ASTM A790 2507 / 2205 1.4462 / 1.4410 Duplexní svařovaná trubice pro chemickou složku chemického průmyslu, Nedostatek SPECC1L vede ke zvýšené stabilitě spojených spojů a sníženému odlupování buněk lebeční neurální lišty.

Děkujeme, že jste navštívili Nature.com.Používáte verzi prohlížeče s omezenou podporou CSS.Chcete-li dosáhnout nejlepšího výsledku, doporučujeme použít aktualizovaný prohlížeč (nebo vypnout režim kompatibility v aplikaci Internet Explorer).Abychom zajistili trvalou podporu, zobrazujeme web bez stylů a JavaScriptu.

ASTM A790 2507 / 2205 1,4462 / 1,4410 Duplexní svařovaná trubka pro chemický průmysl

Liaocheng Sihe SS Material Co., Ltd.je přední výrobce , který se specializuje na bezešvé trubky z nerezové oceli , zářivě žíhané trubky , bezešvé vinuté trubky atd.Abychom zákazníkům usnadnili práci, svařujeme také trubky a trubky.Liaocheng Sihe SS Material Co., Ltd.má nejmodernější výrobní a testovací zařízení.Můžeme zcela uspokojit váš požadavek.Podle normy velmi přísně , námi vyráběné trubky mají vždy správnou toleranci OD a WT .Kontrola tolerance je přísně v souladu s normami výroby.S našimi produkty jsou zákazníci vždy spokojeni.Zákazníci zakoupili naše produkty a vytvořili větší zisky.
a) OD (vnější průměr): 3,18 mm až 101,6 mm
b) WT (Tloušťka stěny): 0,5 mm až 20 mm
c) Délka: Podle požadavku zákazníka
d) Normy: ASTM A312;ASTM A269;ASTM A789;ASTM A790 atd
e) Procesní metoda: ERW, EFW atd

Posuvníky zobrazující tři články na snímku.Pro pohyb mezi snímky použijte tlačítka zpět a další, pro pohyb po jednotlivých snímcích použijte tlačítka posuvného ovladače na konci.
Buňky lebečního neurálního hřebenu (CNCC) se odlupují z embryonálních nervových záhybů a migrují do hltanových oblouků, které tvoří většinu středních struktur.Dysfunkce CNCC hraje důležitou roli v etiologii orofaciálního rozštěpu, běžné vrozené vývojové vady.U pacientů s atypickými a syndromickými rozštěpy byly nalezeny heterozygotní mutace SPECC1L.Zde uvádíme zvýšené barvení složek kanonické adhezivní junkce (AJ), β-kateninu a E-kadherinu v kultivovaných knockdown buňkách SPECC1L a elektronové mikrofotografie ukazují apikálně-bazální difúzi AJ.Abychom pochopili roli SPECC1L v kraniofaciální morfogenezi, vytvořili jsme myší model s deficitem Specc1l.Homozygotní mutanti jsou embryonální letální a vykazují zhoršené uzavření neurální trubice a CNCC laminaci.Barvení proteinu AJ je zvýšeno v mutantních nervových záhybech.Tento defekt AJ je konzistentní s defektem v delaminaci CNCC, který vyžaduje rozpouštění AJ.Kromě toho mutanty Specc11 mají sníženou signalizaci PI3K-AKT a zvýšenou apoptózu.In vitro byla mírná inhibice signalizace PI3K-AKT v buňkách divokého typu dostatečná k indukci změn AJ.Důležité je, že změny AJ vyvolané knockdownem SPECC1L lze zvrátit aktivací dráhy PI3K-AKT.Celkově vzato tato data naznačují, že SPECC1L, jako nový regulátor signalizace PI3K-AKT a biologie AJ, je nezbytný pro uzavření neurální trubice a stratifikaci CNCC.
Buňky lebečního neurálního hřebenu (CNCC) se lokalizují do dorzálního neuroektodermu a oddělují se od neuroepitelu vyvíjejících se nervových záhybů prostřednictvím procesu zahrnujícího epiteliálně-mezenchymální přechod (EMT)1,2,3.Premigrující epiteliální CNCC narušují mezibuněčná spojení a stávají se migrujícími mezenchymálními CNCC, které vyplňují první a druhý faryngeální oblouk a tvoří většinu kraniofaciální chrupavky.Geny, které regulují funkci CNCC, jsou tedy často narušeny v etiologii kraniofaciálních vrozených anomálií, jako jsou orofaciální rozštěpy, nejčastěji postihující 1/800 porodů jen v USA.Jedna z vrozených deformit8.
Delaminace CNCC se shoduje s uzavřením přední nervové trubice mezi 8,5 a 9,5 dnem embryonálního vývoje u myší.Mutanty řady myších genů spojených s orofaciálním rozštěpem také vykazují určitou formu defektu neurální trubice, včetně Irf69,10, Ghrl310, Cfl111 a Pdgfrα12.Procesy uzavírání neurální trubice a stratifikace CNCC lze však považovat za nezávislé, protože myš Splotch mutant (Pax3) vykazuje defekty v uzavření neurální trubice bez jakéhokoli vlivu na stratifikaci nebo migraci CNCC 13,14.Další modely myší s defekty v CNCC disekci a uzávěru neurální trubice pomohou vymezit společný molekulární základ těchto dvou procesů.
Izolace CNCC z neuroepiteliálních buněk vyžaduje rozpuštění adhezivních spojů (AJ), které se skládají z proteinových komplexů obsahujících mimo jiné E-cadherin, β-catenin, α-E-catenin a α-aktinin spojený s aktinovými vlákny 2 Studie nadměrné exprese E-cadherinu v nervových záhybech prokázaly snížení nebo zpoždění delaminace CNCC.Naopak suprese E-cadherinu vede k časné stratifikaci15,16.Mnoho faktorů, které zprostředkovávají EMT během stratifikace CNCC, jsou transkripční faktory (AP2α, Id2, FOXD3, SNAIL, TWIST, SOX10) a proteiny remodelující extracelulární matrix (ECM), jako jsou matrix metaloproteinázy (MMP), nicméně CNCC jsou přímé cytoskeletální AJ regulátory. dosud neznámý.Je známo, že dráha PI3K-AKT antagonizuje hladiny E-cadherinu, zejména z výzkumu rakoviny17.Nedávné studie ukázaly, že ztráta signalizace PI3K-AKT na bázi PDGFα u myší vede ke kraniofaciálním abnormalitám, včetně rozštěpu patra a defektů neurální trubice12.Vztah mezi dráhou PI3K-AKT a stabilitou AJ po stratifikaci CNCC je však nejasný.
Již dříve jsme identifikovali SPECC1L jako první mutantní gen u dvou lidí s těžkou rozštěpem, který se táhne od úst k oku, známý jako šikmý rozštěp (ObFC) nebo Tessier IV18 rozštěp.Mutace SPECC1L byly identifikovány ve dvou vícegeneračních rodinách s autozomálně dominantním Opitz G/BBB syndromem (OMIM #145410), ve kterých postižení jedinci vykazovali hypervzdálenost a rozštěp rtu/patra19, a v jedné rodině se syndromem nadměrné vzdálenosti tibi (OMIM #145420)20 .více než polovina případů Opitz G/BBB syndromu je X-vázaná (OMIM #300000) a je způsobena mutacemi v genu MID1, který kóduje protein 22 buněčného skeletu asociovaného s mikrotubuly.Předpokládáme, že SPECC1L, také protein spojený s mikrotubuly a aktinovým cytoskeletem, může zprostředkovat signalizaci potřebnou pro remodelaci aktinového cytoskeletu během buněčné adheze a migrace18.Prostřednictvím studií in vitro a in vivo nyní popisujeme SPECC1L jako nový regulátor stability AJ prostřednictvím signalizace PI3K-AKT.Na buněčné úrovni měl deficit SPECC1L za následek snížení hladiny proteinu pan-AKT a zvýšení apikálně-bazální disperze AJ, která byla eliminována chemickou aktivací dráhy AKT.In vivo embrya s deficitem Specc11 vykazují zhoršené uzavření neurální trubice a sníženou disekci CNCC.SPECC1L tedy funguje ve vysoce regulované signalizaci založené na buněčné adhezi, která je nezbytná pro normální funkci CNCC během morfogeneze obličeje.
K charakterizaci role SPECC1L na buněčné úrovni jsme použili dříve popsanou stabilní buněčnou linii osteosarkomu U2OS deficitní v SPECC1L18.Tyto stabilní buňky U2OS s knockdownem SPECC1L (kd) měly mírný (60–70 %) pokles hladin transkriptů a proteinů SPECC1L spolu s defekty v migraci a reorganizaci aktinového cytoskeletu 18. Naproti tomu došlo k závažnému přechodnému poklesu Bylo prokázáno, že SPECC1L vede k mitotickým defektům23.Po další charakterizaci jsme zjistili, že naše stabilní buňky SPECC1L-kd změnily morfologii při velmi vysokém stupni konfluence (obrázek 1).Jednotlivé kontrolní buňky a kd buňky při nízké konfluenci vypadaly podobně (obrázek 1A,D).24 hodin po fúzi si kontrolní buňky zachovaly svůj kvádrový tvar (obr. 1B, E), zatímco buňky SPECC1L-kd se prodlužovaly (obr. 1C, F).Rozsah této změny tvaru buněk byl zachycen in vivo živým zobrazováním kontrolních buněk a buněk kd (film 1).Abychom určili roli SPECC1L v konfluentních buňkách, nejprve jsme zkoumali jeho expresi.Zjistili jsme, že hladiny proteinu SPECC1L se po fúzi zvýšily (obrázek 1G), zatímco hladiny transkriptu SPECC1L se nezvýšily (obrázek 1H).Kromě toho, jak se buněčná hustota zvyšovala, protein SPECC1L se akumuloval na mezibuněčných hranicích (obr. 2A-E), se vzorem překrývajícím se se vzorem β-kateninu asociovaného s membránou (obr. 2A'-E').Vzhledem k asociaci SPECC1L s aktinovým cytoskeletem 18,23 jsme předpokládali, že SPECC1L interaguje s adhezivními spoji na bázi aktinu (AJ).
(AF) Buňky SPECC1L knockdown (DF) se prodlužují při vysoké konfluenci (F) ve srovnání s kontrolními buňkami U2OS (AC).Zde jsou zobrazeny tři ze šesti časových bodů (T1, T3, T6), které jsme vybrali pro různé hustoty buněk.(G) Western blot analýza ukazující, že protein SPECC1L je stabilizován při vysokém stupni konfluence ve srovnání s nízkým stupněm konfluence v kontrolních buňkách.Western blot SPECC1L ukazuje očekávaný pás 120 kDa a pás s vyšší molekulovou hmotností, možná posttranslačně modifikovaný (*).Analýza Western blot byla provedena za stejných podmínek pro nízkou a vysokou konfluenci.Obrázky ukazující SPECC1L při nízké a vysoké konfluenci byly pořízeny ze stejného blotu.Stejný blot byl odstraněn a znovu vyšetřen protilátkou proti p-aktinu.(H) Kvantitativní RT-PCR analýza neukázala žádné významné změny v hladinách transkriptu SPECC1L.Chybové úsečky představují SEM ze čtyř nezávislých experimentů.
(AE) Vybrali jsme šest časových bodů (T1-T6) představujících rozsah buněčných hustot pro normalizaci analýzy tvaru buněk a změn AJ v buňkách U2OS s knockdown SPECC1L (kd).Prvních pět z těchto časových bodů zahrnovalo jednotlivé buňky (T1), 50-70% fúzi malých buněčných shluků (T2), fúzi bez přetváření kd buněk (T3), přetváření kd buněk (T4) a 24hodinové změny.v zadní formě buněk kd (T5).Protein SPECC1L byl převážně rozptýlen v cytoplazmě v T1 (A), ale jeho akumulace byla pozorována na mezibuněčných hranicích v následujících časových bodech (B–E, šipky).(FJ) β-catenin vykazuje podobnou akumulaci na mezibuněčných hranicích souvisejících s komplexem AJ.(A'-E') SPECC1L a β-catenin vykazují překrývající se barvení na hranicích buněk při vysoké hustotě buněk (šipky).(F'-J') V buňkách SPECC1L-kd se barvení β-kateninu jeví jako normální při nízké hustotě buněk (F'-H'), ale rozšiřuje se, jak se mění tvar buněk (I', J'; šipky), což naznačuje, že AJ změnil se.Pruhy = 10 um.
Poté jsme se pokusili určit vliv deficitu SPECC1L na AJ.Použili jsme několik markerů spojených s AJ, včetně kanonických složek F-aktin, myosin IIb, β-catenin a E-cadherin24,25,26,27.Vlákna aktinového stresu vzrostla v buňkách SPECC1L-kd, jak bylo popsáno dříve (Obr. 3A, B)18.Myosin IIb asociovaný s aktinovými vlákny vykazoval podobné zvýšení v buňkách SPECC1L-kd in vitro (obr. 3C, D).AJ-asociovaný β-catenin se váže na kadherin na buněčné membráně, což ukazuje normální „voštinový“ expresní vzor v kontrolních kubocytech (obr. 3E,G).Je zajímavé, že na plochých snímcích pomocí konfokální mikroskopie vykazovalo barvení β-kateninem (obr. 3E,F) a E-cadherinem (obr. 3G,H) na buněčné membráně konfluentních buněk s deficitem SPECC1L výrazné vzory rozšířeného barvení.Tato expanze AJ-asociovaného p-kateninového barvení v kd buňkách byla nejvýraznější při konfluenci, ale zdálo se, že předchází změnám ve tvaru buněk (obr. 2F-J, F'-J').Abychom určili fyzikální povahu tohoto rozšířeného AJ barvení, zkoumali jsme buněčné hranice na apikálně-bazálním povrchu buněk SPECC1L-kd U2OS pomocí transmisní elektronové mikroskopie (TEM) (obrázek 3I,J).Na rozdíl od kontrolních buněk (obr. 3I), které měly oddělené oblasti elektronové hustoty indikující AJ (šipky), buňky kd (obr. 3J) vykazovaly velké, souvislé oblasti s vysokou hustotou elektronů indikující AJ podél apikobazální roviny..Kromě toho jsme na příčných řezech pozorovali rozsáhlé záhyby buněčné membrány v buňkách kd (obr. S1A,B), což vysvětluje rozšířený vzor pruhů barvení β-kateninem a E-cadherinem (obr. 3F,H).Na podporu úlohy SPECC1L v AJs byl p-katenin koimunoprecipitován se SPECC1L v lyzátech konfluentních buněk U2OS (obr. 3K).Spolu s rozšířeným imunobarvením na markery AJ byla analýza TEM v souladu s naší hypotézou, že nedostatek SPECC1L zvyšuje apikálně-bazální hustotu a rozptyl AJ.
(AH) Zvýšené barvení F-aktinu v kd buňkách 48 hodin po fúzi (T6; A, B).Změněné barvení myosinu IIb spojeného s F-aktinem (C, D).Hladký vzor barvení β-kateninu a E-kadherinové membrány v kontrolních buňkách (E, G) byl zesílen v buňkách SPECC1L-kd (F, H).Pruhy = 10 um.(I–J) Elektronové mikrofotografie pozorující apikálně-bazální mezibuněčné spojení.Kontrolní buňky vykazují odlišné oblasti s hustotou elektronů indikující lepivé spoje (I, šipky).Na rozdíl od toho se celé apikálně-bazální spojení v buňkách SPECC1L-kd jevilo jako elektronově husté (J, šipky), což ukazuje na zvýšenou hustotu a disperzi adhezivních spojení.(K) β-catenin byl koimunoprecipitován se SPECC1L v konfluentních U2OS buněčných lyzátech.Obrázek pořízený z jednoho místa představujícího jeden ze čtyř nezávislých experimentů.
Abychom pochopili roli SPECC1L v kraniofaciální morfogenezi, vytvořili jsme myší model s deficitem Specc1l pomocí dvou nezávislých buněčných linií ES past, DTM096 a RRH048 (BayGenomics, CA), které představují intron 1 a transkripty Specc1l byly zachyceny v 15 (obr. 1) .4A, obrázek S2).Genomické umístění inzertu návnadového vektoru bylo určeno sekvenováním celého genomu a potvrzeno pomocí PCR (obr. S2).Oba návrhy genových pastí také umožňovaly po zachycení fúzi reportérů Specc11-lacZ v rámci.Proto byla jako indikátor exprese Speccl 1 použita exprese lacZ stanovená barvením X-gal.Obě alely vykazovaly podobné vzory exprese lacZ, přičemž genová past DTM096 v intronu 1 vykazovala silnější expresi než RRH048 v intronu 15 (nezobrazeno).Specc1l je však široce exprimován, se zvláště silnou expresí v nervových záhybech v E8.5 (obrázek 4B), v neurální trubici a obličejových výběžcích v E9.5 a E10.5 (obrázek 4C,D) a ve vyvíjejících se končetinách. na E10.5 a oči (obrázek 4D).Již dříve jsme uvedli, že exprese SPECC1L v prvním faryngeálním oblouku v E10.5 byla přítomna v epitelu a pod ním ležícím mezenchymu18, což je v souladu s linií CNCC.Pro testování exprese SPECC1L v CNCC jsme provedli E8.5 neurální záhyby (obrázek 4E-J) a řezy lebky E9.5 (obrázek 4K-).V E8.5 SPECC1L intenzivně barvil neurální záhyby (obr. 4E, H), včetně buněk obarvených NCC markery (obr. 4G, J).V E9.5, SPECC1L (obr. 4K, N) silně obarvený migrující CNCC společně obarvený s AP2A (obr. 4L, M) nebo SOX10 (obr. 40, P).
(A) Schematické znázornění myšího genu Specc11 ukazující inzerci návnadového vektoru v buněčných klonech ES DTM096 (intron 1) a RRH048 (intron 15).(BD) lacZ barvení heterozygotních embryí Speccl1DTM096 představujících expresi Speccl od E8.5 do E10.5.NE = neuroektoderm, NF = nervový záhyb, PA1 = první faryngální oblouk.(EP) Imunobarvení SPECC1L s NCC markery AP2A a SOX10 v E8.5 (NF; EJ) nervových záhybech a E9.5 (KP) řezech lebky.Barvení SPECC1L bylo široce pozorováno v nervových záhybech E8.5 (E, H; hroty šipek), včetně buněk značených AP2A (F, G; hroty šipek) a SOX10 (I, J; hroty šipek).V E9.5 SPECC1L silně obarvil migrující CNCC (K, N; šipky) označené AP2A (L, M; šipky) a SOX10 (O, P; šipky).
Křížení mezi heterozygotními myšmi Specc11DTM096/+ a Specc1lRRH048/+ ukazuje, že dvě alely genové pasti nejsou komplementární a že složenou heterozygoti a embryonální homozygoty pro kteroukoli alelu genové pasti jsou embryonálně letální (tabulka S1).Mendelovské poměry naznačovaly pokles míry přežití heterozygotů při narození (očekávaná hodnota 1,34 vs. 2,0).U heterozygotů jsme zaznamenali nízkou perinatální mortalitu, někteří měli kraniofaciální anomálie (obr. S3).Nízká penetrance těchto perinatálních kraniofaciálních fenotypů však ztěžuje studium jejich základních patofyziologických mechanismů.Proto jsme se zaměřili na embryonální letální fenotyp homozygotních mutantů Specc11.
Většina složených heterozygotních nebo homozygotních mutantních embryí Specc1lDTM096/RRH048 se nevyvinula po E9,5–10,5 (obr. 5A–D) a neurální trubice se neuzavřela vpředu (obr. 5B, D) a někdy se uzavřela i vzadu (nezobrazeno). ..Tento defekt uzávěru lebeční neurální trubice byl spojen s tím, že většina CNCC označených DLX2 zůstala v nervových záhybech v E10,5, což ukazuje, že nedochází k disekci (obrázek 5A'-D').Abychom zjistili, zda byla také zmenšena celková velikost CNCC, označili jsme linie CNCC pomocí GFP v našich liniích genových pastí pomocí Wnt1-Cre a ROSAmTmG.Z celých embryí streamujeme tříděné GFP+ NCC a GFP- (RFP+) non-NCC.V E9.5 se podíl průtokově tříděných CNCC značených GFP významně nezměnil mezi WT a mutantními embryi (nezobrazeno), což ukazuje na normální CNCC specifikaci.Proto jsme předpokládali, že zbytkové barvení Wnt1-Cre a DLX2 v exponovaných nervových záhybech (obrázek 5B') bylo způsobeno defektním vrstvením CNCC, pravděpodobně v důsledku zvýšené hustoty nebo disperze buněk AJ, jak je vidět u buněk SPECC1L-kd.K potvrzení přítomnosti CNCC v neurální řase jsme použili NCC markery SOX10, AP2A a DLX2 (obrázek 5E-R).V E8.5 bylo pozorováno barvení nervových záhybů pro všechny tři NCC markery v řezech WT (obr. 5E, G, I) a mutantu Speccl (obr. 5F, H, J).V E9.5, zatímco NCC markery barvily migrující NCC v řezech WT (obr. 5M, O, Q), bylo pozorováno zbytkové barvení NCC v exponovaných nervových záhybech mutantních embryí Speccll (obr. 5N, P, R).Protože SOX10 a DLX2 označují migrující CNCC, tento výsledek naznačuje, že CNCC s deficitem SPECC1L dosahují postmigrační specifikace, ale nemigrují z nervových záhybů.
Deficit Specc11 vede k defektnímu uzávěru neurální trubice, delaminaci buněk lebeční neurální lišty a AJ.
(A, B') E9.5 WT (A) Embryo nesoucí migrující buňky lebeční neurální lišty (CNCC) označené Wnt1-Cre (A').Naproti tomu mutantní embrya Specc11 vykazují otevřené nervové záhyby (B), šipky) a CNCC, které nemigrovaly (B', šipky).(C, D') Snímky ve světlém poli (C, D') a imunobarvení (C', D') CNCC markeru DLX2 embryí E10.5 WT (C, C') a Speccll (D, D').U embryí WT E10.5 DLX2-pozitivní CNCC kolonizují žaberní oblouky (C', šipky), zatímco u mutantů přetrvává nápadné barvení v otevřených nervových záhybech (D', šipky) a v prvních hltanových obloucích (D', šipky).) s určitým zabarvením (šipky) indikujícím špatnou delaminaci a migraci CNCC.ER) Řezy mutantních embryí WT a Specc1l ve stádiích E8.5 (E–L) a E9.5 (M–R) byly označeny NCC markery SOX10 (E, F, M, N), AP2A (G, H, O, P) a DLX2 (I, J, Q, R).V E8.5 bylo pozorováno NCC barvení v neurálním záhybu divokého typu (NF) a mutantních řezech.Společné barvení SOX10 a β-kateninu v E8.5 WT (K) a mutantu (L) odhalilo zvýšené barvení β-kateninu na buněčných hranicích v nervových záhybech.V E9.5 bylo pozorováno barvení migrujících CNCC divokého typu (M, O, Q), zatímco u mutantů nestratifikované CNCC barvily otevřené nervové záhyby (N, P, R).(S–Z) In vivo analýza značení AJ v koronálních řezech embryí WT a Specc11DTM096/RRH048 s mutací E9.5.V pravém horním rohu je zobrazena přibližná rovina řezu.V řezech mutantních tkání bylo pozorováno zvýšené barvení F-aktinu (S, T) a myosinu IIb (U, V).Podobně jako u výsledků in vitro na obr. 3 bylo u mutantních embryí pozorováno zesílené barvení membrány na β-catenin (W, X) a E-cadherin (Y, Z).(AA-BB) Elektronový mikrofotografie řezu embrya divokého typu, který se dívá za hranici apikálně-bazální buňky, ukazuje zřetelnou elektronově hustou oblast indikující adhezivní spojení (AA, šipky).Naproti tomu v řezech mutantních embryí Specc11 (BB, šipky) je celé apikobazální spojení elektronově husté, což ukazuje na zvýšenou hustotu a disperzi adhezivních spojení.
Abychom otestovali naši hypotézu, že snížené vrstvení je způsobeno změněným AJ, zkoumali jsme značení AJ v exponovaných nervových záhybech mutantních embryí Speccll (obr. 5S-Z).Pozorovali jsme nárůst aktinových stresových vláken (obr. 5S, T) a současně zvýšenou lokalizaci barvení myosinem IIB na aktinových vláknech (obr. 5U, V).Důležité je, že jsme pozorovali zvýšené barvení β-kateninu (obr. 5W,X) a E-cadherinu (obr. 5Y,Z) na mezibuněčných hranicích.Také jsme zkoumali β-kateninové barvení NCC v nervových záhybech embryí E8.5 (obr. 5K, L).Barvení β-kateninu se zdálo být silnější v neurálních záhybech mutantu Speccll (obr. 5L a K), což naznačuje, že začaly změny AJ.Na elektronových mikrofotografiích řezů lebky embryí E9.5 jsme opět pozorovali zvýšené difúzní elektron-denzní barvení u mutantních embryí Speccll ve srovnání s WT (obr. 5AA, BB a S1E-H).Celkově vzato tyto výsledky podporují naše výsledky in vitro u buněk SPECC1L-kd U2OS a naznačují, že aberantní barvení AJ předchází stratifikaci CNCC v našich mutantních embryích.
Vzhledem ke známému antagonistickému vztahu mezi aktivitou AKT a stabilitou E-cadherinu17,28 jsme předpokládali zapojení signalizace PI3K-AKT.Kromě toho jsme pozorovali subepidermální puchýře u některých našich mutantních embryí, která unikla letalitě (<5 %) v E9,5-10,5 a místo toho se usadila kolem E13,5 (obr. S3).Subepidermální vezikuly jsou charakteristickým znakem snížené signalizace PI3K-AKT na základě PDGFRα12.Fantauzzo a kol.(2014) uvedli, že narušení aktivace PI3K na bázi PDGFRα u mutantních embryí PdgfraPI3K/PI3K má za následek vznik subepidermálních váčků, defektů neurální trubice a fenotypů rozštěpu patra.Ve skutečnosti byly hladiny pan-AKT a aktivního fosforylovaného Ser473-AKT sníženy in vivo v tkáních mutantu Speccl1 na E9.5 embryonální zástavu (obr. 6A-D).Snížení hladin fosforylovaného Ser473-AKT může být zcela způsobeno snížením hladin pan-AKT in vivo (obr. 6E) a in vitro (obr. 6F).Snížení in vitro bylo pozorováno pouze tehdy, když byly buňky U2OS silně konfluentní se změnami tvaru buněk a hustoty AJ (obrázek 6D).Naše data tedy naznačují, že SPECC1L je nový pozitivní regulátor signalizace PI3K-AKT v kraniofaciální morfogenezi.
(A–E) E8.5 (A,B) a E9.5 (C,D) řezy lebky nebo E9.5 lyzáty z mutantních embryí Speccll (E) vykazující hladiny aktivní fosforylované S473-AKT a pan-AKT redukce proteinu ve srovnání s kontrolním WT.Western blot byl proveden na lyzátech divokého typu a mutantních lyzátech za stejných podmínek.Obrázky zobrazené pro SPECC1L byly pořízeny z jednoho blotu.Stejný blot byl odstraněn a znovu vyšetřen s anti-pan-ACT a p-aktinovými protilátkami.Hladiny pan-AKT v E8.5 nervových záhybech (A, B) a hladiny fosforylovaného S473-AKT v E9.5 řezech lebky byly významně sníženy.(F) Hladiny Pan-AKT byly podobně sníženy v lyzátech buněk SPECC1L-kd U2OS sklizených při vysoké konfluenci.Chybové úsečky představují SEM ze tří nezávislých kvantifikace Western blot.(GJ) Řezy embryí WT v E9.5 obarvené KI67 a štěpenou kaspázou 3, v daném pořadí, vykazující buněčnou proliferaci (G, G') a malou apoptotickou aktivitu (H, H').Mutovaná embrya Speccl1 vykazují srovnatelnou buněčnou proliferaci (I), ale počet buněk podléhajících apoptóze je významně zvýšený (J).
Poté jsme zkoumali markery proliferace a apoptózy.Nepozorovali jsme žádný rozdíl v proliferaci embryí E9.5 (obr. 6E, G ve srovnání s I) s indexem proliferace 82,5 % pro mutanty WT a 86,5 % pro mutanty Specc1l měřeno barvením KI67 (p < 0,56, Fisher's přesný test).Podobně jsme nepozorovali žádný rozdíl v apoptóze měřené barvením na štěpenou kaspázu 3 v nervových záhybech v E8,5 až do zástavy embrya (nezobrazeno) (nezobrazeno).Naproti tomu apoptóza byla významně zvýšena u všech E9.5 mutantních embryí (obr. 6F, H a J).Toto celkové zvýšení apoptózy je v souladu se sníženou signalizací PI3K-AKT a časnou embryonální letalitou29,30,31.
Dále, abychom potvrdili kauzální roli signalizace PI3K-AKT ve změnách AJ v našich kd buňkách, chemicky jsme změnili dráhu v kontrolních a kd buňkách (obrázek 7A-F).Jako marker jsme použili fenotyp změny tvaru buňky pozorovaný u konfluentních buněk SPECC1L-kd, který jsme kvantifikovali pomocí poměru nejdelšího rozměru (délky) k odpovídajícímu vertikálnímu rozměru (šířce).Pro relativně kulaté nebo krychlové buňky se očekává poměr 1 (obrázek 7G).Kromě tvaru buněk jsme také potvrdili vliv na AJ barvením β-kateninem (obr. 7A'-F').Inhibice dráhy PI3K-AKT pomocí wortmanninu byla dostatečná pro změnu tvaru buněk v kontrolních buňkách (obrázek 7A, C) a AJ (obrázek 7A').PI3K-AKT aktivátor SC-79 neovlivnil tvar buněk (OBR. 7A, E) nebo AJ expanzi (OBR. 7A') v kontrolních buňkách.V buňkách SPECC1L-kd vedlo další potlačení dráhy PI3K-AKT ke zvýšené apoptóze (obr. 7B, D) a výraznému zvýšení barvení p-kateninu (obr. 7B'), což je v souladu s našimi těžkými mutanty in vivo.Důležité je, že aktivace dráhy PI3K-AKT významně zlepšila tvar buněk (obrázek 7B, F) a fenotypy AJ (obrázek 7B“).Změny ve tvaru buněk byly kvantifikovány jako poměr kulatosti buněk (CCR) a porovnány z hlediska významnosti, jak je popsáno výše (obr. 7G).V kontrolních buňkách (obr. 7G, CCR = 1,56) bylo ošetření wortmanninem dostatečné k významné změně tvaru buněk (obr. 7G, CCR = 3,61, p < 2,4 × 10-9) v rozsahu podobném pozorovanému ve SPECC1L.-kd buňky (obr. 7G, CCR = 3,46).Ošetření buněk SPECC1L-kd wortmanninem (obr. 7G, CCR = 3,60, zanedbatelné) nebylo významnější než neošetřené buňky kd (obr. 7G, CCR = 3,46, zanedbatelné) nebo kontrolní buňky ošetřené wortmanninem (obr. 7G)., CCR = 3,46, zanedbatelné) navíc ovlivňuje prodloužení buněk (7G, CCR = 3,61, zanedbatelné).Nejdůležitější je, že aktivátor SC-79 AKT obnovil prodloužený fenotyp buněk SPECC1L-kd (obr. 7G, CCR = 1,74, p < 6,2 × 10-12).Tyto výsledky potvrzují, že SPECC1L reguluje signalizaci PI3K-AKT a naznačují, že mírný pokles SPECC1L ovlivňuje buněčnou adhezi, zatímco silný pokles vede k apoptóze (obr. 8).
(A–F') Kontrolní (A, C, E) a SPECC1L-kd (B, D, F) buňky ošetřené inhibitorem dráhy PI3K-AKT wortmanninem (C, D) nebo aktivátorem SC-79 (E, F) Léčba Neošetřené kontrolní buňky jsou krychlové (A) s normálním barvením buněk β-cat (A'), zatímco buňky kd jsou protáhlé (B) se zvýšeným barvením β-cat (B').Po potlačení dráhy PI3K-AKT se kontrolní buňky prodloužily (C) s expanzí β-cat (C'), zatímco buňky kd začaly podléhat apoptóze (D), podobně jako naše vysoce mutovaná embrya a vykazovaly extrémně zesílenou β-cat.barvení (D').Po aktivaci dráhy PI3K-AKT kontrolní buňky zůstaly kvádrové (E) a měly normální barvení β-cat (E'), zatímco buňky kd vykazovaly významně zlepšený tvar buněk (F) a barvení β-cat (F'), což naznačuje (G) Stupeň změny tvaru buňky v (AF) byl kvantifikován pomocí poměru zaoblení buněk (CCR) nejdelšího rozměru (délka) a odpovídajícího vertikálního rozměru (šířka) pomocí softwaru MetaMorph.Neošetřené (NT) buňky SPECC1L-kd (CCR = 3,46) byly významně delší než kontrolní buňky (CCR = 1,56, p < 6,1 × 10–13).Wortova inhibice dráhy PI3K-AKT v kontrolních buňkách byla dostatečná k tomu, aby způsobila podobné prodloužení ve tvaru buněk (CCR=3,61, p<2,4x10-9).Podobně aktivace AKT pomocí SC-79 v buňkách SPECC1L-kd obnovila elongaci buněk na kontrolní úrovně (CCR = 1,74, p < 6,2 × 10–12).Ošetření buněk SPECC1L-kd wortmanninem vedlo ke zvýšené apoptóze, ale žádné další zvýšení změny tvaru buněk (CCR=3,60) ve srovnání s neošetřenými kd (CCR=3,46, ns) nebo kontrolními buňkami ošetřenými wortmanninem (3,61) pozorovaným v .ns = nezáleží.Jsou ukázána měření +/- SEM pro 50 buněk.Statistické rozdíly byly vypočteny pomocí Studentova t-testu.
(A) Schematické znázornění inhibice a aktivace dráhy PI3K-AKT vedoucí ke změnám AJ a záchraně, v daném pořadí.(B) Navrhovaný model pro stabilizaci proteinu AKT pomocí SPECC1L.
Premigrující CNCC vyžadují AJ lýzu, aby se oddělily od neuroepiteliálních buněk předního nervového záhybu1,15,32.Zvýšené barvení složek AJ a ztráta apikálně-bazální asymetrické distribuce AJ v buňkách s deficitem SPECC1L in vitro i in vivo v kombinaci s fyzickou blízkostí SPECC1L k β-kateninu naznačují, že SPECC1L funguje tak, aby správně udržoval lokální stabilitu AJ pro organizační svaly.aktinový cytoskelet.Asociace SPECC1L s aktinovým cytoskeletem a β-cateninem a zvýšení počtu kondenzovaných aktinových filament v nepřítomnosti SPECC1L je v souladu s pozorovaným zvýšením hustoty AJ.Další možností je, že zvýšený počet aktinových vláken v buňkách s deficitem SPECC1L vede ke změně mezibuněčného napětí.Protože buněčný stres ovlivňuje dynamiku AJ 33, změny napětí mohou vést k difúznějšímu AJ 34.Jakékoli změny tedy ovlivní vrstvy CNCC.
Wnt1 je exprimován v časných nervových záhybech, které dávají vzniknout buňkám neurální lišty.Sledování linie Wnt1-cre tedy označuje NCC35 před migrací i migrací.Wnt1 však také označuje klony dorzální mozkové tkáně také odvozené z časných nervových záhybů35,36, takže je pravděpodobné, že naše barvení mutantů E9.5 pro markery Wnt1 v otevřených nervových záhybech není CNCC.Naše pozitivní barvení na NCC markery AP2A a SOX10 potvrdilo, že exponované nervové záhyby mutantních embryí Specc11 skutečně obsahovaly CNCC.Kromě toho, protože AP2A a SOX10 jsou markery časně migrujícího NCC, pozitivní barvení ukázalo, že tyto buňky jsou postmigrační CNCC, které nelze stratifikovat pomocí E9.5.
Naše data naznačují, že molekulární regulace AJ pomocí SPECC1L je zprostředkována signalizací PI3K-AKT.Signalizace AKT je snížena v SPECC1L deficitních buňkách a tkáních.Zjištění Fantauzza et al.podporují přímou roli signalizace PI3K-AKT v kraniofaciální morfogenezi.(2014) ukázali, že nedostatek aktivace signalizace PI3K-AKT na bázi PDGFRα vede k fenotypu rozštěpu patra.Také jsme ukázali, že inhibice dráhy PI3K-AKT je dostatečná ke změně AJ a tvaru buněk v buňkách U2OS.V souladu s našimi zjištěními Cain et al.37 ukázal, že downregulace podjednotky PI3K a110 v endoteliálních buňkách má za následek podobné zvýšení pericelulárního barvení β-kateninu, označované jako zvýšení „indexu konektivity“.Avšak v endoteliálních buňkách, jejichž aktinová vlákna jsou již vysoce organizovaná, vede potlačení dráhy PI3K-AKT k volnému tvaru buněk.Naproti tomu buňky SPECC1L-kd U2OS vykazovaly podlouhlý buněčný tvar.Tento rozdíl může být specifický pro typ buňky.Zatímco potlačení signalizace PI3K-AKT trvale ovlivňuje aktinový cytoskelet, vliv na tvar buňky je dán změnami napětí způsobenými změnami v hustotě a organizaci centrálních aktinových vláken.V buňkách U2OS jsme použili pouze změny tvaru buněk jako marker změny a zotavení AJ s deficitem SPECC1L.Na závěr předpokládáme, že inhibice dráhy AKT u deficitu SPECC1L zvyšuje stabilitu AJ a snižuje delaminaci v CNCC.
Je zajímavé, že hladiny pan-AKT byly sníženy in vitro a in vivo navíc k hladinám fosforylovaného 473-AKT v nepřítomnosti SPECC1L, což naznačuje regulaci signalizace PI3K-AKT na úrovni stability nebo obratu proteinu AKT.Geny SPECC1L a MID1, oba spojené s Opitz/GBBB syndromem, kódují proteiny, které stabilizují mikrotubuly18,22.Mechanismus, kterým SPECC1L a MID1 zprostředkovávají stabilizaci mikrotubulů, není plně objasněn.V případě SPECC1L tato stabilizace zahrnuje zvýšenou acetylaci podskupiny mikrotubulů18.Je možné, že SPECC1L používá podobný mechanismus ke stabilizaci jiných proteinů, jako je AKT.Bylo prokázáno, že acetylace lysinových zbytků v proteinu AKT vede ke snížení membránové lokalizace a fosforylace38.Kromě toho je pro jeho membránovou lokalizaci a aktivaci nutná ubikvitinace řetězce K63 na stejném lysinovém zbytku na AKT39,40.Mezi několika faktory interagujícími s proteiny SPECC1L identifikovanými v různých vysoce výkonných kvasinkových dvouhybridních screeningech se čtyři – CCDC841, ECM2942, APC a UBE2I43 – podílely na obratu nebo stabilitě proteinu prostřednictvím ubikvitinace nebo sumoylace.SPECC1L se může podílet na posttranslační modifikaci lysinových zbytků AKT, což ovlivňuje stabilitu AKT.Zbývá však objasnit kritickou roli SPECC1L v lokalizaci a stabilitě proteinu AKT.
Závažné defekty v expresi SPECC1L in vivo vedly ke zvýšenému barvení AJ markerů a defektnímu překrytí CNCC, stejně jako ke zvýšené apoptóze a časné embryonální letalitě.Předchozí zprávy ukázaly, že myší mutanty se zvýšenými hladinami apoptózy jsou spojeny s defekty neurální trubice 44, 45, 46, 47 a kraniofaciálními defekty48.Bylo navrženo, že nadměrná buněčná smrt v nervových záhybech nebo hltanových obloucích může mít za následek nedostatečný počet buněk potřebných pro správný morfogenetický pohyb48,49,50.Naproti tomu naše SPECC1L deficitní buněčné linie se středně sníženou expresí SPECC1L vykazovaly pouze změny AJ bez důkazu zvýšené buněčné smrti.Chemická inhibice dráhy PI3K-AKT v těchto buňkách Kd však vedla ke zvýšené apoptóze.Mírný pokles exprese nebo funkce SPECC1L tedy zajišťuje přežití buněk.To je v souladu s pozorováním, že vzácná embrya mutantu Specc11, která uniknou zástavě při st.E9.5 - možná kvůli snížené účinnosti zachycení genů - jsou schopni uzavřít své nervové trubice a zastavit se později ve vývoji, často s kraniofaciálními defekty (obr. S3).V souladu s tím je také vzácný výskyt heterozygotních embryí Specc1l s kraniofaciálními abnormalitami – pravděpodobně kvůli zvýšené účinnosti zachycení genů – a také nález u zebřičky, u které jeden ze dvou ortologů SPECC1L (specc1lb) způsobuje pozdní embryonální fenotypy, včetně ztráty dolní čelisti a oboustranné rozštěpy51.Heterozygotní mutace ztráty funkce SPECC1L identifikované u lidských pacientů tedy mohou způsobit malá poškození funkce SPECC1L během kraniofaciální morfogeneze, což je dostatečné k vysvětlení jejich orofaciálních rozštěpů.Regulace mezibuněčných kontaktů založená na SPECC1L může také hrát roli v palatogenezi a fúzi faryngálních oblouků.Další studie funkce SPECC1L pomohou objasnit roli dočasných mezibuněčných kontaktů u CNCC během uzávěru neurální trubice v motilitě neuroepiteliálních buněk a kraniofaciální morfogenezi.
Kontrola osteosarkomu U2OS a buňky SPECC1L-kd byly popsány dříve (Saadi et al., 2011).Protilátky proti SPECC1L byly také charakterizovány dříve (Saadi et al., 2011).Protilátky proti β-kateninu (králík; 1:1000; Santa Cruz, Dallas, TX) (myš; 1:1000; Cell Signaling Technology, Danvers, MA), myosin IIb (1:1000; Sigma-Aldrich, St. Louis ), MO), E-cadherin (1:1000; Abkam, Cambridge, MA), AP2A (1:1000; Novus Biologicals, Littleton, Colorado), SOX10 (1:1000; 1000; Aviva Systems Biology, San Diego , Kalifornie), DLX2 (1:1000; Abcam, Cambridge, MA), fosfo-Ser473-AKT (1:1000; Cell Signaling Technology, Danvers, MA), pan-AKT (1:1000; ThermoFisher Scientific, Waltham, MA ), KI67 (1:1000; Cell Signaling Technology, Danvers, MA), štěpená kaspáza 3 (1:1000; Cell Signaling Technology, Danvers, MA) a β-aktin (1:2500; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) byl použit, jak je popsáno..Aktinová vlákna byla obarvena Acti-stain rhodamin faloidinem (Cytoskeleton, Denver, Colorado).
Kontrolní buňky U2OS a buňky SPECC1L-kd byly kultivovány ve standardním DMEM s vysokým obsahem glukózy doplněném 10% fetálním bovinním sérem (Life Technologies, Carlsbad, CA).Pro změny AJ bylo 2 x 105 buněk nasazeno na sklo ošetřené 0,1% prasečí želatinou (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) a pozorovány změny tvaru buněk.Buňky byly odebrány v různých uvedených časových bodech: 4 hodiny po naočkování (t = 1), 24 hodin po naočkování (t = 2), konfluence beze změny tvaru buněk (t = 3), změna tvaru buněk (t = 4) , 24 h po změně tvaru buňky (t = 5) a 48 h po změně tvaru buňky (t = 6) (obr. 1, 2, 3).Pro modulaci dráhy PI3K-AKT byly buňky kultivovány v uvedených koncentracích s inhibitorem PI3K-AKT wortmanninem (TOCRIS Biosciences, Minneapolis, Minnesota) nebo aktivátorem SC-79 (TOCRIS Biosciences, Minneapolis Adams, Minnesota).Médium obsahující chemikálie se vyměňovalo denně.
Záznamy snímek po snímku byly prováděny na živých kontrolních a KD buňkách za normálních kultivačních podmínek a snímky fázového kontrastu byly shromažďovány každých 10 minut po dobu 7 dnů.Snímky byly pořízeny pomocí počítačem řízeného inverzního mikroskopu Leica DM IRB vybaveného mechanickým stolkem a objektivem 10 × N-PLAN připojeným ke kameře QImaging Retiga-SRV.Během zobrazování byly buněčné kultury udržovány při 37 °C ve vlhké atmosféře s 5 % CO2.
Dvě buněčné linie ES genové pasti DTM096 a RRH048 z Regional Mutant Mouse Resource Center (UC Davis, CA) byly použity k vytvoření Specc11 deficitních myších linií, označených SpeccllgtDTM096 a SpeccllgtRRH046.Stručně, 129/REJ ES buňky byly injikovány do C57BL6 blastocyst.Výslední chiméričtí samci myší byli množeni se samicemi myší C57BL6, aby se identifikovali potomci se zbarvením srsti aguti.Přítomnost vektorových inzertů genové pasti byla použita k identifikaci heterozygotů.Myši byly chovány na smíšeném pozadí 129/REJ;C57BL6.Umístění místa inzerce vektoru genetické pasti bylo potvrzeno RT-PCR, sekvenováním genomu a genetickou komplementací (doplňkový obrázek 1).Pro sledování CNCC linie dvojitě heterozygotních myší Specc11GT byly zkříženy myši ROSAmTmG (#007576) a Wnt1-Cre (#003829) (Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME), aby produkovaly alelu ROSAmTmG a Wnt1-Cre v embryích mutantů Speccll.Všechny experimenty na myších byly prováděny podle protokolů schválených Institutional Animal Care and Use Committee of the University of Kansas Medical Center.
Embrya byla fixována v (1 % formaldehyd, 0,2 % glutaraldehyd, 2 mM MgCl2, 0,02 % NP-40, 5 mM EGTA) po dobu 60 minut při teplotě místnosti.Po fixaci v barvícím roztoku X-gal (5 mM ferrikyanid draselný, 5 mM ferrokyanid draselný, 2 mM MgCl2, 0,01 % deoxycholát sodný, 0,02 % NP-40, 1 mg/ml X-gal) bylo vyvíjení barvení provedeno při 37 °C .°C během 1-6 hodin.Embrya byla dodatečně fixována ve 4% PFA a vizualizována.
Pro Western blotting byly buňky lyžovány v pasivním lyzačním pufru (Promega, Fitchburg, WI) doplněném směsí inhibitorů proteázy HALT (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO).Lyzáty byly zpracovány na 12% polyakrylamidových Mini-PROTEAN TGX hotových gelech (Bio-Rad, Hercules, CA) a přeneseny na membrány Immobilon PVDF (EMD Millipore, Billerica, MA).Membrány byly blokovány v 5% mléce v PBS obsahujícím 0,1% Tween.Protilátky byly inkubovány přes noc při 4 °C nebo po dobu jedné hodiny při teplotě místnosti.Pro generování signálu bylo použito činidlo Femto SuperSignal West ECL (Thermo Scientific, Waltham, MA).Pro imunobarvení byla embrya fixována přes noc ve 4% PFA/PBS a kryokonzervována.Tkáňové kryosekce byly blokovány v PBS obsahujícím 1% normální kozí sérum (Thermo Scientific, Waltham, MA) a 0,1% Triton X-100 (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) a poté inkubovány při 4 °C v inkubátoru během noc.s anti-protilátkou a fluorescenční sekundární protilátkou (1:1000) po dobu 1 hodiny při 4 °C.Obarvené řezy byly umístěny do zlatého média ProLong (Thermo Scientific, Waltham MA) a ploché snímky byly získány pomocí konfokálního mikroskopu Leica TCS SPE.Každé imunobarvení bylo provedeno jako tři nezávislé experimenty na cirosekcích alespoň dvou mutantních embryí.Je ukázán reprezentativní experiment.
Buňky byly inkubovány v modifikovaném RIPA pufru (20 mM Tris-HCl, pH 8,0, 1 % NP-40, 130 mM NaCl, 10 % glycerol, 2 mM EDTA a inhibitor proteázy HALT (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) Stručně řečeno, lyzáty byly předem purifikovány magnetickými kuličkami s proteinem G (Life Technologies, Carlsbad, CA) a poté inkubovány přes noc při 4 °C s anti-SPECC1L nebo IgG protein G proteinové kuličky byly použity k extrakci SPECC1L a bylo provedeno Western blotting s použitím anti-SPECC1L. Protilátka -p-katenin popsaná výše Ukázané ko-IP experimenty reprezentují čtyři nezávislé experimenty.
Fixované kultivované buňky nebo myší embryonální tkáně byly poskytnuty centru elektronové mikroskopie na University of Kansas Medical Center.Stručně, vzorky byly zality do pryskyřice EMbed 812 (Electron Microscopy Sciences, Fort Washington, PA), polymerovány přes noc při 60 °C a nařezány při 80 nm pomocí ultramikrotomu Leica UC7 vybaveného diamantovou čepelí.Řezy byly vizualizovány pomocí transmisního elektronového mikroskopu JEOL JEM-1400 vybaveného 100 kV Lab6 pistolí.
Jak citovat tento článek: Wilson, NR et al.Nedostatek SPECC1L vede ke zvýšené stabilitě sestřižených kloubů a snížené delaminaci buněk lebeční neurální lišty.věda.6, 17735;doi:10.1038/srep17735 (2016).
Saint-Jeanne, J.-P.Indukce a diferenciace neurální lišty.(Springer Science + Business Media; Landes Bioscience/Eurekah.com, 2006).
Cordero, DR a kol.Buňky lebeční neurální lišty v pohybu: jejich role v kraniofaciálním vývoji.American Journal of Medical Genetics.Část A 155A, 270–279, doi:10.1002/ajmg.a.33702 (2011).
Boland, RP Neurocristopathia: její růst a vývoj v průběhu 20 let.Dětský lékař.patologie.laboratoř.lék.17, 1-25 (1997).
Mangold E., Ludwig KU a Noten MM Průlom v genetice orofaciálních rozštěpů.Trends in Molecular Medicine 17, 725–733, doi:10.1016/j.molmed.2011.07.007 (2011).
Minu, M. a Riley, FM Molekulární mechanismy migrace buněk lebečního neurálního hřebenu a vzorování během kraniofaciálního vývoje.Vývoj 137, 2605–2621, doi: 10.1242/dev.040048 (2010).
Dixon, MJ, Marazita, ML, Beaty, TH a Murray, JK Rozštěp rtu a patra: porozumění genetickým vlivům a vlivům prostředí.přirozený komentář.Genetics 12, 167–178, doi: 10.1038/nrg2933 (2011).
Ingram, ČR a kol.Abnormální morfogeneze kůže, končetin a kraniofaciální oblasti u myší s deficitem interferon-regulačního faktoru-6 (Irf6).Národní Genette.38, 1335–1340, doi: 10.1038/ng1903 (2006).
Peyrard-Janvid, M. a kol.Dominantní mutace v GRHL3 způsobují van der Waordův syndrom a narušují vývoj peridermu dutiny ústní.Am J Hum Genet 94, 23–32, doi: 10.1016/j.ajhg.2013.11.009 (2014).
Harris, MJ a Juriloff, DM Aktualizujte seznam myších mutantů s defekty v uzávěru neurální trubice a pokročte směrem k úplnému genetickému pochopení uzávěru neurální trubice.Vyšetřování vrozených vad.Část A, Klinická a molekulární teratologie 88, 653–669, doi: 10.1002/bdra.20676 (2010).
Fantauzzo, KA & Soriano, P. Signalizace PDGFRalfa zprostředkovaná PI3K reguluje přežití a proliferaci ve vývoji skeletu prostřednictvím intracelulární dráhy závislé na p53.Gene Development 28, 1005–1017, doi: 10.1101/gad.238709.114 (2014).
Kopp, AJ, Green, ND a Murdoch, JN Disheveled: Vztah konvergentní expanze k uzavření neurální trubice.Trendy v neurologii.26, 453–455, doi: 10.1016/S0166-2236(03)00212-1 (2003).