310 10*1mm Chemická složka spirálových trubek z nerezové oceli ,N-terminální domény spidroinu tvoří hydrogely na bázi amyloidních fibril a poskytují platformu pro imobilizaci proteinů.

Děkujeme, že jste navštívili Nature.com.Používáte verzi prohlížeče s omezenou podporou CSS.Chcete-li dosáhnout nejlepšího výsledku, doporučujeme použít aktualizovaný prohlížeč (nebo vypnout režim kompatibility v aplikaci Internet Explorer).Abychom zajistili trvalou podporu, zobrazujeme web bez stylů a JavaScriptu.
Posuvníky zobrazující tři články na snímku.Pro pohyb mezi snímky použijte tlačítka zpět a další, pro pohyb po jednotlivých snímcích použijte tlačítka posuvného ovladače na konci.

Specifikace

310 10*1mm Dodavatelé spirálových trubek z nerezové oceli

Chemické složení

Mechanické vlastnosti

Rekombinantní proteiny pavoučího hedvábí (proteiny pavoučího hedvábí) mají mnoho potenciálních aplikací při vývoji nových biomateriálů, ale jejich multimodální povaha a náchylnost k agregaci ztěžuje jejich získání a snadné použití.Zde uvádíme, že rekombinantní miniaturní spidroinové proteiny a, což je důležité, samotná N-terminální doména (NT) rychle tvoří samonosné a transparentní hydrogely při 37 °C.fúzní proteiny sestávající z NT a zeleného fluorescenčního proteinu nebo purinové nukleosid fosforylázy tvoří plně funkční fúzní proteiny.Hydrogely.Naše výsledky ukazují, že rekombinantní NT a fúzní proteiny poskytují vysoké výtěžky exprese a dodávají hydrogelům atraktivní vlastnosti, jako je průhlednost, gelovatění bez síťování a přímá imobilizace aktivních proteinů při vysoké hustotě.
Pavouci mají až sedm různých sad hedvábných žláz, z nichž každá produkuje specifický typ hedvábí.Všech sedm druhů hedvábí je složeno z proteinů pavoučího hedvábí (spidroinů) dlouhých přibližně 6000 zbytků a obsahuje velkou centrální opakující se oblast obklopenou sférickými N- a C-terminálními doménami (NT a CT)1,2.Nejvíce studovaný typ hedvábí, primární ampulka, je produkován primární ampulovou žlázou.V této žláze monovrstva epiteliálních buněk syntetizuje proteiny spidroinu a vylučuje je do lumen žlázy, kde jsou přítomny v rozpustné formě (doping) v extrémně vysokých koncentracích (30–50 % w/v)3,4.O organizaci a konformaci hlavních ampulárních spidroinových proteinů ve žláze se diskutovalo, ale většina experimentálních důkazů ukazuje na přítomnost obecně helikální a/nebo náhodné helikální konformace a micelárních nebo lamelárních struktur5,6,7,8,9,10.Zatímco repetitivní domény regulují mechanické vlastnosti hedvábných vláken, tvoří nanokrystaly β-listu a amorfní struktury11,12,13,14,15, koncové domény regulují hedvábná vlákna v reakci na měnící se podmínky podél hedvábné žlázy16,17,18.Řízením tvorby hedvábí, 19. Terminální domény jsou evolučně konzervovány a jejich funkce může být společná všem spidroinovým proteinům 2,20,21.Během průchodu žlázou se pH spidroinu snižuje z přibližně 7,6 na < 5,716 a zvyšuje se střihem a natahováním zprostředkovaným pohybem postupně se zužujícím kanálkem.V roztoku je CT α-helikální konstitutivní paralelní dimer17, ale v reakci na nízké pH a smykové síly se CT rozvine a přepne β-vrstvy16, 17, což možná spustí β-vrstvy v repetitivních oblastech Convert 16. NT jsou monomerní pod podmínky odrážející podmínky v lumen žlázy a zprostředkovávají rozpustnost spidroinu, ale při sníženém pH vede protonace řady postranních řetězců karboxylových kyselin k dimerizaci NT s pKa přibližně 6,5, čímž dochází ke stabilizaci NT a fixaci spidroinu ve velkém množství.sítě16,18.NT tedy hraje klíčovou roli při tvorbě filamentu, mění se z monomeru v povlaku na dimer ve vláknu23,24,25.NT zůstává vysoce rozpustný a šroubovicový za všech dosud studovaných podmínek16, 18, 19, 20, 26, 27, 28, 29, což inspirovalo jeho vývoj jako značky zvyšující rozpustnost pro produkci heterologních proteinů.
Rekombinantní mini protein pavoučího hedvábí, skládající se z jednoho NT, jedné krátké opakující se oblasti, jednoho CT a značky His6 (His-NT2RepCT) pro čištění, je stejně rozpustný ve vodném pufru jako nativní protein pavoučího hedvábí a napodobuje důležité přirozené vlastnosti pavouka hedvábného. .pokrytí 25.31.His-NT2RepCT lze spřádat do souvislých vláken pomocí biomimetického stroje, ve kterém je rozpustný povlak o pH 8 extrudován do vodní lázně s pH 525,32,33,34,35.Fermentace E. coli exprimující His-NT2RepCT v bioreaktoru a následné následné ošetření vedly k výtěžku >14 g/l po čištění.Vysoký výtěžek, vysoká rozpustnost a adekvátní reakce His-NT2RepCT na kyselé podmínky jsou všechny připisovány NT23, 25, 34.
Zde uvádíme rychlou tvorbu transparentních hydrogelů z rekombinantních spidroinových proteinů, včetně samotného NT, inkubací proteinového roztoku při 37 °C.Pomocí fluorescence thioflavinu T (ThT), infračervené spektroskopie s Fourierovou transformací (FTIR), nukleární magnetické rezonanční spektroskopie (NMR) a transmisní elektronové mikroskopie (TEM) jsme zjistili, že proteiny NT a mikropavouků procházejí strukturní transformací na β-listy a fibrily podobné amyloidu když se tvoří gely.Navíc fúzní proteiny NT a zelený fluorescenční protein (GFP) nebo purinová nukleosid fosforyláza (PNP) tvoří hydrogely s plně funkčními fúzními fragmenty.Vysoce výkonná exprese v heterologních hostitelích spojená s rychlou tvorbou hydrogelů za fyziologických podmínek otevírá možnost nákladově efektivní produkce hydrogelů s umělými funkcemi.
Na rozdíl od většiny uváděných rekombinantních spidroinových proteinů36 je His-NT2RepCT stabilní v Tris-HCl pufru při pH 8 a může být koncentrován až na 500 mg/ml bez precipitace25.Proto nás překvapilo zjištění, že tento protein rychle tvoří opticky čiré, samonosné hydrogely, když je inkubován při 37 °C (obr. lb-d).Další studie ukázaly, že ke gelaci His-NT2RepCT došlo v širokém rozmezí koncentrací proteinu (10–300 mg/ml) a že tato koncentrace nepřímo korelovala s dobou gelace (obr. 1c a doplňkový obr. 1).Abychom zjistili, které části His-NT2RepCT zprostředkovávají tvorbu hydrogelu, zkoumali jsme každou doménu jednotlivě a v různých kombinacích pomocí testu inverze baňky (obrázek 1a,b).Všechny testované frakce rekombinantního spidroinu vytvořily gely (při koncentraci proteinu 300 mg/ml) za méně než 1 hodinu, s výjimkou vysráženého 2Rep (obr. 1b).To naznačuje, že NT a CT samotné, v kombinaci nebo spojené s repeticemi, mohou gelovatět při 37 °C a že značka His6 tento proces ve významném rozsahu neovlivňuje.Vzhledem k obecné představě, že NT je vysoce rozpustný a stabilní protein a že předchozí zprávy o rekombinantních spidroinových hydrogelech připisovaly gelační účinky konformačním změnám v opakujících se oblastech a/nebo CT, NT sám by mohl.Objev gelovatění byl neočekávaný.Doplňková tabulka 1) 37, 38, 39. Je pozoruhodné, že NT již geloval během 10 minut v koncentraci ≥ 300 mg/ml (obr. 1c).Experimenty s inverzí lahvičky s různými koncentracemi NT ukázaly, že při >50 mg/ml roztok NT geloval rychleji než His-NT2RepCT při odpovídající koncentraci (w/v, obrázek 1c).
Schematické znázornění různých spidroinových konstruktů studovaných v této práci.b Doba gelovatění při 37 °C pro různé rekombinantní spidroinové proteiny (300 mg/ml) ověřená převrácením lahvičky.CT gel ihned bez inkubace (<300 mg/ml), 2Rep precipitáty (300 mg/ml, měřítko 5 mm).c Doba gelovatění His-NT2RepCT a NT při uvedených koncentracích proteinu při 37 °C.d Fotografie hydrogelů His-NT2RepCT a NT s vytištěným pavoukem a písmenem „NT“ (oba 200 mg/ml, stupnice 5 mm).
Hydrogely tvořené různými rekombinantními spidroinovými proteiny mají mírně odlišné barvy a pozorování pouhým okem ukazuje různé stupně průhlednosti (obr. 1b).NT gely jsou výjimečně čiré, zatímco jiné gely se stávají neprůhlednými.Gely His-NT2RepCT a NT odlité do válcových trubek mohly být vyjmuty z formy neporušené (obr. 1d).
Aby se otestovalo, zda povlaky přírodního pavoučího hedvábí gelují za podmínek, o kterých se nyní zjistilo, že způsobují gelovatění rekombinantních proteinů spidroinu, byly povlaky odebrány z velké ampulky u švédského můstkového pavouka (Larinioides sclopetarius).Povlaky byly skladovány v 20 mM Tris-HCl pufru při 50 mg/ml (na základě naměřené suché hmotnosti), ale během 21denní inkubace při 37 °C nebyla pozorována žádná gelovatění (doplňkový obrázek 2a).
Ke kvantifikaci těchto gelů lze použít reologická měření ke studiu procesu gelovatění a stanovení celkových mechanických vlastností.Zejména monitorování skladovacího modulu (elasticity) při zvýšených teplotách může poskytnout informace o teplotě gelovatění a také o viskoelastických vlastnostech povlaku.Experimenty s nárůstem teploty (s použitím 1 °C/min při 25-45 °C, na základě předchozích studií s použitím zásobních roztoků přírodního hedvábí)40,41 ukázaly, že skladovací moduly roztoků His-NT2RepCT a NT se zvyšují se zvyšující se teplotou.byla zvýšena (obr. 2 a doplňkový obr. 3).Je pozoruhodné, že modul NT začal růst při nižší teplotě ve srovnání s His-NT2RepCT, což je v souladu s rychlejší dobou gelovatění pozorovanou, když byl NT přímo inkubován s His-NT2RepCT při 37 °C (obrázek 1).Po následném poklesu teploty se akumulační modul nevrátil na nižší hodnoty a zůstal nad ztrátovým modulem (viz doplňkový obr. 3), což ukazuje na tepelně nevratnou stabilní gelaci.Po gelaci se konečný modul pružnosti pohyboval od 15 do 330 kPa pro hydrogely His-NT2RepCT při koncentraci 100–500 mg/ml a konečný modul pružnosti pro hydrogely NT (100–500 mg/ml) se pohyboval od 2 do 1400 kPa (obr. , 2 a kompletní údaje rampy) viz doplňkový obr. 3).
a Změna teploty během měření His-NT2RepCT (300 mg/ml) a b NT (300 mg/ml) za třepání.Šipky označují trend teploty a světlejší stínování dat paměťového modulu znázorňuje testování při nižších hodnotách točivého momentu pro přístroj, než uvádí výrobce, což je příčinou zvýšené hlučnosti.c Akumulace His-NT2RepCT a NT na konci modulu po zvýšené teplotě (100, 300 a 500 mg/ml).Všechny údaje modulu jsou snímány s frekvencí 0,1 Hz.
Jako potenciální metodu pro zkoumání konformačních změn spojených s gelovatěním jsme zaznamenali FTIR spektra His-NT2RepCT a NT před a po gelaci při 37 °C (obrázek 3a,b).Jak se očekávalo, spektra roztoků His-NT2RepCT a NT odpovídala proteinům vykazujícím sekundární strukturu a-helix/random coil s výrazným pásem při 1645 cm-1.U obou hydrogelů vedla gelace k vytvoření dvou ramen ve středním I pásu při asi 1617 cm-1 a 1695 cm-1 (obr. 3a, b), což ukazuje na tvorbu antiparalelních struktur β-listu.Tyto změny lze také jasně vidět v příslušných druhých derivačních a diferenčních gelačních spektrech (doplňkový obrázek 4b).Dva pruhy NT p-vrstvy byly výraznější než pruhy His-NT2RepCT, což ukazuje, že celkový obsah pruhů p-vrstvy v NT hydrogelu byl vyšší než u hydrogelu NT2RepCT.
FTIR absorpční spektra His-NT2RepCT a b NT (obě 500 mg/ml) před (roztok) a po (gel) inkubaci při 37 °C.c TEM snímky resuspendovaných 50 mg/ml NT2RepCT gelů a d NT.Měřítko 200 nm.e Průměry vláken His-NT2RepCT a NT hydrogelů.n = 100 naměřených fibril, p < 0,0001.Chybové úsečky ukazují směrodatnou odchylku.Střed chybových úseček je průměr.Pro statistickou analýzu byl použit nepárový t-test (dvoustranný).f ThT fluorescence různých rekombinantních spidroinových proteinů (100 mg/ml) při 37 °C bez třepání.g NT (100 mg/ml) inokulační experimenty ze 100 mg/ml NT gelu s 0 %, 5 %, 10 % a 20 % semen.
Analýza gelu pomocí transmisní elektronové mikroskopie (TEM) ukázala, že hydrogel se skládá z fibril podobných amyloidu (obr. 3c, 3d).NT-formované fibrily byly prodloužené (5–12 nm v průměru) a nevětvené, zatímco His-NT2RepCT fibrily byly kratší na délku a významně širší v průměru (7–16 nm) (obr. 3e).Tyto výsledky nám umožnily sledovat kinetiku fibrózy pomocí testu thioflavinu T (ThT).U všech rekombinantních spidroinových proteinů se fluorescenční signál zvýšil, když byly vzorky inkubovány při 37 °C (obr. 3f, doplňkový obr. 5a).V souladu s tímto zjištěním mikroskopické vyšetření NT a His-NT2RepCT za podmínek gelovatění odhalilo jednotné zvýšení fluorescence ThT bez patrné místní akumulace ThT-pozitivních agregátů (doplňkový obrázek 5b, c).Tvorba ThT-pozitivních fibril nebyla doprovázena zvýšením zákalu NT a His-NTCT (doplňkový obr. 5d), což znamená, že se mohla vytvořit síť fibril v gelu, aniž by byla ohrožena čirost gelu.Naočkování přidáním malých množství předem vytvořených fibril může významně urychlit tvorbu fibril některých amyloidů42,43,44, ale přidáním 5 %, 10 % nebo 20 % (w/w) NT do roztoku NT hydrokoagulantů.seedací efekt (obr. 3g).Možná je to způsobeno tím, že fibrily v hydrogelu jsou relativně fixované a nelze je použít jako semena.
Neočekávané chování rekombinantních spidroinových proteinů při vysokých teplotách podnítilo další studie nukleární magnetické rezonance (NMR) k identifikaci konformačních změn spojených s tvorbou gelu.NMR spektra roztoků His-NT2RepCT zaznamenaná v průběhu času při 37 °C ukázala, že CT byla stále částečně složená, zatímco signály NT a 2Rep zmizely (obr. 4a), což naznačuje, že to byly hlavně NT a 2Rep, které částečně kontrolovaly tvorbu His- NT2RepCT hydrogel.Signál CT byl také zeslaben na 20 % své původní intenzity, což naznačuje, že CT je také většinou fixováno a začleněno do hydrogelové struktury.Pro menší část CT, která je stejně mobilní jako v předinkubovaném vzorku, a tedy pozorována pomocí NMR v roztoku, spektru postrádají signály pro prvních 10 strukturovaných zbytků, pravděpodobně kvůli obtížné imobilizaci připojené části His-NT2Rep.NMR spektra -stavu hydrogelů -NT2RepCT odhalila převládající přítomnost α-helixů a β-vrstev a v menší míře i konformaci náhodného klubka (obr. 4b).Analýza chemického posunu methioninových zbytků přítomných pouze v NT ukázala, že tato doména byla převedena na strukturu β-listu.Časově závislá spektra NT v roztoku ukázala rovnoměrný pokles intenzity signálu (obr. 4c) a NMR NT hydrogelů v pevné fázi ukázala, že většina zbytků NT byla převedena na struktury β-listu (obr. 4d).Konformaci 2Rep nebylo možné určit samostatně kvůli jeho tendenci agregovat.Spektra NMR v pevném stavu hydrogelů NTCT a His-NT2RepCT však vypadala velmi podobně (obr. 4b; doplňkový obr. 6b), což naznačuje, že 2Rep přispěl málo ke strukturální části hydrogelu His-NT2RepCT.U CT hydrogelů bylo zjištěno, že existují α-helixy, β-listy a náhodné helikální sekundární struktury (doplňkový obrázek 6d).To naznačuje, že některé části CT zůstávají α-helixy, zatímco jiné se stávají β-listy.Výsledky NMR spektroskopie tedy naznačují, že NT je důležitý pro tvorbu hydrogelu a také se po fúzi s 2Rep a CT transformuje na konformaci β-listu.V souladu s tím jsme nedávno zjistili, že amyloidní prostorové zipy se pravděpodobně tvoří ve všech pěti helixech NT domény a Waltzův algoritmus předpověděl amyloidogenní oblast ve šroubovici 1 (obr. 4e).
2D spektra 15N-HSQC 10 mg/ml roztoku His-NT2RepCT před (modrá) a 19 hodin po inkubaci (červená) při 37 °C.Jednotlivé křížové píky v červeném spektru a F24, G136, polyA v modrém spektru jsou označeny jednopísmennými symboly aminokyselin a čísly zbytků.Vložky ukazují závislost intenzity signálu na čase pro vybrané zbytky z domén NT, 2Rep a CT.b Pevná radiofrekvenční spektra (RFDR) hydrogelů His-NT2RepCT.Korelace zbytků Cα/Cβ pozorovaných ve spektrech RFDR byly stanoveny srovnáním s modelovými chemickými posuny peptidů a hodnotami odvozenými ze statistik82,83 a jejich sekundárních struktur.SSB – otočné postranní pásmo.c Jednorozměrná spektra roztoku 15N-HSQC 10 mg/ml NT během inkubace při 37 °C po dobu 36 hodin.Vložka ukazuje objemovou intenzitu v závislosti na čase.d Pevná RFDR spektra NT hydrogelů.Jsou uvedeny korelace zbytků Ca/Cp a jejich sekundárních struktur pozorovaných ve spektrech RFDR.e Na základě profilu náchylnosti k fibrilaci NT45.79 z databáze Zipper (https://services.mbi.ucla.edu/zipperdb/).Rosetta energie okna prostorového posunu blesku hexapeptidu je uvedena v kcal/mol.Červené sloupce označují hexapeptidy s vysokým sklonem k fibróze (energie Rosetta pod -23 kcal/mol; pod tečkovanou čarou).Zelené pruhy označují úlomky s energiemi Rosetta nad prahovou hodnotou, a proto je méně pravděpodobné, že vytvoří sterické zipy.Fragmenty obsahující prolin byly z analýzy vyloučeny (bez kolon).Čtverce označují oblasti amyloidózy předpovězené algoritmem Waltz81 (https://waltz.switchlab.org).Sekvence aminokyselinových zbytků NT je nahoře a typy zbytků nalezených v β sekundární struktuře (určené NMR spektroskopií v pevné fázi) jsou zobrazeny červeně.Polohy pěti NT a-helixů jsou označeny jako (H1-H5)28.
Při pH < 6,5 HT dimerizuje a je odolný vůči denaturaci vyvolané teplem nebo močovinou18.Aby se objasnilo, jak dimerizace a stabilita NT ovlivňují gelaci, roztoky obsahující 100 mg/ml NT byly kontrolovány při pH 8, 7 a 6 pomocí testu inverze lahvičky.Vzorky NT inkubované při pH 8 a 7 zgelovatěly po 30 minutách při 37 °C, ale gel s pH 8 zůstal čirý, zatímco gel s pH 7 vykazoval viditelnou sraženinu (obr. 5a).Na rozdíl od toho roztok obsahující HT při pH 6 nevytvořil gel a velká sraženina byla vidět po 20 minutách při 37 °C.To naznačuje, že samotné dimery a/nebo jejich vyšší stabilita ve srovnání s monomery brání gelovatění.Tvorba sraženiny pro NT při pH 7 a 6 se neočekávala, protože bylo uvedeno, že NT je rozpustný při 200 mg/ml27, snadno se znovu složí po tepelné denaturaci a také si zachovává α-šroubovici při nižších hodnotách pH 18. Pravděpodobným vysvětlením těchto nesrovnalostí je, že dříve uváděné experimenty byly prováděny při pokojové teplotě nebo nižší nebo při relativně nízkých koncentracích proteinů16,18,19.
NT test inverze lahvičky (100 mg/ml) při pH 8, 7, 6 a 154 mM NaCl (pH 8) po inkubaci při 37 °C.b NT CD spektra s a bez 154 mM NaF a 154 mM NaCl, v daném pořadí.Molární elipticita při 222 nm je převedena na podíl přirozených záhybů.c Test inverze NT (100 mg/ml) NT* (37 °C a 60 °C), NTA72R (37 °C) a His-NT-L6 (37 °C a 60 °C).d CD spektra NT mutantů NT*, NTA72R a His-NT-L6.Molární elipticita při 222 nm je převedena na podíl přirozených záhybů.e Inverzní test NTFlSp, NTMiSp a redukovaného NTMiSp (100 mg/ml).Měřítko 5 mm.f CD spektra NT, NTFlSp, NTMiSp a redukovaného NTMiSp.Molární elipticita při 222 nm je převedena na podíl přirozených záhybů.Plná NT spektra při 25 °C a 95 °C jsou zobrazena na doplňkovém obrázku 8.
Fyziologická koncentrace soli určuje elektrostatické interakce mezi podjednotkami NT a dimerizaci přenosu NT na nižší pH18.Zjistili jsme, že přítomnost 154 mM NaCl a NaF skutečně inhibovala gelaci (obr. 5a, b; doplňkový obr. 2b) a že tyto soli zvýšily tepelnou stabilitu NT monomerů (obr. 5b, doplňkový obr. 8). .To také naznačuje, že zvýšení stability, spíše než dimerizace, zabraňuje tvorbě gelu.
Abychom dále prozkoumali úlohu dimerizace a stability proteinu v gelaci, použili jsme dva mutanty, NT* a NTA72R, které také zůstávají monomerní při nízkém pH 28,30.NT* je mutant s dvojitým reverzním nábojem, ve kterém je zjevná dipolární distribuce náboje monomeru zploštělá, což zabraňuje dimerizaci a drasticky zvyšuje stabilitu monomeru.NTA72R je nabitý dipól, ale Arg-substituovaná Ala se nachází na hranici dimeru, takže mutace interferují s interakcemi podjednotek potřebnými pro dimerizaci.Po inkubaci při 37 °C NT* nevytvořil hydrogel, zatímco NTA72R vytvořil neprůhledný gel po dobu 15 minut (obr. 5c).Protože jak NT*, tak NTA72R nemohou dimerizovat, ale liší se ve stabilitě monomeru (obr. 5d), tyto výsledky silně naznačují, že vysoká termodynamická stabilita zabraňuje gelovatění NT.To je podpořeno také skutečností, že HT* tvoří gel, když je nestabilní při vysoké teplotě (po 8 minutách při 60 °C; obr. 5c).Již dříve bylo prokázáno, že vysoký obsah methioninu v NT zkapalňuje jeho přirozené skládání a že šest substitutů Met až Leu (zde označovaných jako His-NT-L6) silně stabilizuje monomer NT46.Na základě předpokladu, že pro tvorbu NT gelu je nutná strukturální flexibilita, jsme zjistili, že stabilní mutant His-NT-L6 negelovatí při 37 °C (obrázek 5c, d).His-NT-L6 však také vytvořil gel po inkubaci při 60 °С po dobu 60 minut (obr. 5c).
Zdá se, že schopnost NT transformovat se na struktury β-listu a tvořit hydrogely platí pro některé, ale ne všechny NT domény spidroinu.NT z různých typů hedvábí a druhů pavouků, Trichonephila clavipes (NTFlSp), vytvořily gely navzdory jejich relativně nízkému obsahu methioninu a vysoké tepelné stabilitě (obr. 5e, f a doplňková tabulka 2).Naproti tomu NT z malého ampulárního proteinu spidroinu z Araneus ventricosus (NTMiSp) s nízkou tepelnou stabilitou a vysokým obsahem methioninu nevytvářel hydrogely (doplňková tabulka 2 a obr. 5e, f).Ten může být spojen s přítomností intramolekulárních disulfidových vazeb29,47.V souladu s tím, když byly disulfidové vazby NTMiSp redukovány, vytvořil hydrogel po inkubaci při 37 °C po dobu 10 minut (obr. 5e).Na závěr je třeba poznamenat, že strukturální flexibilita je důležitým, ale ne jediným kritériem pro tvorbu gelu z NT.Dalším faktorem, který může být relevantní, je sklon k tvorbě amyloidních fibril a analýza s databází zipu a algoritmem Waltz ukázala korelaci mezi schopností tvořit gely a přítomností amyloidogenních oblastí, stejně jako rozsahem předpokládaných oblastí. k vytvoření sterických zipů.Byla zjištěna korelace (doplňková tabulka 2 a doplňkový obr. 9).
Schopnost NT tvořit fibrily a tvořit gely za příznivých podmínek nás vedla k hypotéze, že fúze NT s jinými proteinovými fragmenty mohou stále tvořit gely s plnou funkcí fúzních partnerů.Abychom to otestovali, zavedli jsme zelený fluorescenční protein (GFP) a purinovou nukleosidovou fosforylázu (PNP) na C-konec NT.Výsledné fúzní proteiny byly exprimovány v E. coli s velmi vysokými konečnými výtěžky (150 mg/l a 256 mg/l kultury v třepacích lahvích pro His-NT-GFP a His-NT-PNP, v tomto pořadí), v souladu s tím, co bylo ukázáno pro jiné proteiny fúzované k NT Ref.30. His-NT-GFP (300 mg/ml) a His-NT-PNP (100 mg/ml) fúzní proteiny vytvořily gely po 2 hodinách a 6,5 ​​hodinách při 37 °C, a co je důležité, frakce GFP zůstala nezměněna.pozorováno po gelovatění, přičemž >70 % počáteční intenzity fluorescence zůstalo po gelovatění (obr. 6a).Abychom změřili aktivitu PNP v roztocích a gelech his-NT-PNP, museli jsme fúzní protein zředit NT, protože enzymatická aktivita čistého přípravku byla mimo detekční rozsah testu při gelujících koncentracích.Gel vytvořený se směsí obsahující 0,01 mg/ml His-NT-PNP a 100 mg/ml NT si zachoval 65 % počáteční enzymatické aktivity preinkubovaných vzorků (obr. 6b).Gel zůstal během měření neporušený (doplňkový obr. 10).
a Relativní intenzita fluorescence před a po gelovatění His-NT-GFP (300 mg/ml) a obrácená lahvička obsahující hydrogel His-NT-GFP (300 mg/ml) pod viditelným a UV světlem.Body ukazují jednotlivá měření (n = 3), chybové úsečky ukazují směrodatnou odchylku.Průměrná hodnota je zobrazena ve středu chybových pruhů.b Aktivita PNP byla získána fluorometrickou analýzou za použití roztoků a gelů sestávajících z NT (100 mg/ml) a směsi obsahující 0,01 mg/ml his-NT-PNP a 100 mg/ml nových tchajwanských dolarů.Vložka ukazuje obrácenou lahvičku obsahující hydrogel obsahující His-NT-PNP (sloupec měřítka 5 mm).
Zde uvádíme tvorbu hydrogelů z NT a dalších rekombinantních spidroinových proteinů inkubací proteinového roztoku při 37 °C (obrázek 1).Ukazujeme, že gelovatění je spojeno s přeměnou α-helixů na β-vrstvy a tvorbou amyloidních fibril (obr. 3 a 4).Toto zjištění je překvapivé, protože NT jsou stočené globulární pětišroubovicové svazky známé svou extrémně vysokou rozpustností a vysokou stabilitou při koncentracích > 200 mg/ml při 4 °C po několik dní27.Kromě toho se NT snadno znovu skládají po tepelné denaturaci při nízkých koncentracích proteinu v uM.Podle našich výsledků vyžaduje tvorba fibril kombinaci koncentrace proteinu >10 mg/ml a mírně zvýšenou teplotu (obr. 1).To je v souladu s myšlenkou, že amyloidní fibrily se mohou tvořit z globulárně složených proteinů, které jsou v částečně rozvinutém stavu v důsledku tepelných fluktuací za fyziologických podmínek48.Příklady proteinů, které procházejí touto konverzí, zahrnují inzulín49,50, β2-mikroglobulin, transtyretin a lysozym51,52,53.Ačkoli je NT ve svém přirozeném stavu a-helix, přibližně 65 % polypeptidového řetězce je kompatibilních s tvorbou sterického zipu (obr. 4e)45.Jelikož je monomer dynamicky mobilní46, může tyto potenciální amyloidogenní oblasti vystavit při mírně zvýšených teplotách a při vysokých koncentracích celkového proteinu může dosáhnout kritické koncentrace pro tvorbu amyloidních fibril54.Na základě této úvahy jsme našli negativní korelaci mezi koncentrací spidroinu a dobou gelace (obr. 1c), a pokud je monomerní konformace NT stabilizována buď mutacemi (NT*, His-NT-L6) nebo přidáním soli, může zabránit tvorba hydrogelů (obr. 5).
Ve většině případů amyloidní fibrily zmizí z roztoku jako sraženina, ale za určitých podmínek mohou tvořit hydrogely55,56,57.Fibrily tvořící hydrogel mají typicky vysoký poměr stran a tvoří stabilní trojrozměrné sítě prostřednictvím molekulárního propletení,55,58 v souladu s našimi výsledky.Pro tvorbu hydrogelu in vitro se proteiny často zcela nebo částečně rozvinou, například vystavením organickým rozpouštědlům, vysoké teplotě (70–90 °C) a/nebo nízkému pH (1,5–3,0)59,60,61,62.Zde popsané spidroinové hydrogely nevyžadují drsné zpracování ani nevyžadují síťovací činidla pro stabilizaci hydrogelů.
Již dříve bylo hlášeno, že spidroinové repetice a QD, které zřejmě podléhají přepínání β-listu během spřádání hedvábí, tvoří hydrogely.Ve srovnání s našimi zjištěními byly inkubační doby a/nebo inkubační teploty významně delší nebo vyšší a výsledné hydrogely byly často neprůhledné (obrázek 7 a doplňková tabulka 1) 37, 38, 63, 64, 65, 66, 67, 68 , 69. Kromě rychlých gelovacích časů překonaly NT hydrogely >300 mg/ml (30 %) všechny ostatní popsané rekombinantní hydrogely s proteinem z pavoučího hedvábí, stejně jako přírodní hydrogely, jako je želatina, alginát (2 %), agar (0,5 % ) a kolagenu.(0,6 %) (obrázek 7 a doplňkové tabulky 1 a 3)37,39,66,67,68,69,70,71,72,73,74.
Doba gelovatění a modul pružnosti hydrogelů v této studii byly porovnány s jinými hydrogely na bázi spidroinu a vybranými přírodními hydrogely.Odkazy jsou uvedeny spolu s popisem podmínek gelovatění.APS Persíran amonný, pokojová teplota.Údaje 37, 38, 39, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74.
Zdá se, že pavouci vyvinuli způsoby, jak zabránit gelovatění spidroinu během skladování.Navzdory vysoké koncentraci proteinu v hedvábné žláze, velká repetitivní oblast spojená s terminální doménou znamená, že zdánlivá koncentrace NT a CT ve žláze odpovídá přibližně 10-20 mg/ml, na hranici této studie.potřebné pro in vitro pozorovanou tvorbu hydrogelu.Navíc podobné koncentrace solí 16 stabilizovaly NT jako u hedvábných žláz (obr. 5b).NT konformace byla studována v cytosolu E. coli a bylo zjištěno, že je těsněji složena než při zkoumání in vitro, což dále ukazuje, že sůl nebo jiné faktory brání její agregaci in vivo.Schopnost NT transformovat se na fibrily β-listu však může být důležitá pro tvorbu filamentů a měla by být zkoumána v budoucích studiích.
Kromě nových aspektů tvorby NT-amyloidových fibril a hydrogelu pozorovaných v této studii také ukazujeme, že tento jev může mít biotechnologické a biomedicínské aplikace (obr. 8).Jako důkaz konceptu jsme zkombinovali NT s GFP nebo PNP a ukázali, že fúzní protein také tvoří hydrogely, když je inkubován při 37 ° C a že frakce GFP a PNP si do značné míry zachovávají svou aktivitu po gelaci (obrázek 6).Nukleosidové fosforylázy jsou důležitými katalyzátory syntézy nukleosidových analogů75, díky čemuž je náš objev relevantní pro biofarmaceutický průmysl.Koncept exprese fúzních proteinů, které tvoří transparentní hydrogely za příznivých podmínek, umožňuje tvorbu funkcionalizovaných hydrogelů s příznivými vlastnostmi pro širokou škálu aplikací, jako je imobilizace enzymů, řízené uvolňování léčiv a tkáňové inženýrství.NT a NT* jsou navíc účinné expresní markery30, což znamená, že NT a jeho varianty lze použít pro vysoce výkonnou produkci rozpustných fúzních proteinů a následnou tvorbu imobilizovaných cílových proteinů v 3D hydrogelech.
NT je rozpustný, a-helikální a stabilní při nízkých koncentracích (µM) a 37 °C.Při stejné teplotě, ale při zvyšujících se koncentracích (>10 mg/ml) tvoří NT gely sestávající z fibril podobných amyloidu.Fúzní proteiny NT také tvoří fibrilární gely s plně funkčními fúzními fragmenty, což umožňuje imobilizaci různých proteinů v 3D hydrogelech pomocí NT.Dole: NT (PDB: 4FBS) a ilustrace vláknových sítí a přidružených proteinových struktur (předpokládáno a nekresleno v měřítku, GFP PDB: 2B3Q, 10.2210/pdb2B3Q/pdb; PNP PDB: 4RJ2, 10.2210/pdb4RJ2/pdb).
Konstrukty (viz doplňková tabulka 4 pro úplný seznam včetně aminokyselinových sekvencí) byly klonovány do plazmidu pT7 a transformovány do E. coli BL21 (DE3).E. coli obsahující upravené plazmidy byly inokulovány v bujónu Luria doplněném kanamycinem (70 mg/l) a pěstovány přes noc při 30 °C a 250 ot./min.Kultura byla poté naočkována 1/100 do LB média obsahujícího kanamycin a kultivována při 30 °C a 110 rpm, dokud OD600 nedosáhla 0,8.Pro NMR studie byly bakterie pěstovány v minimálním médiu M9 obsahujícím 2 g D-glukózy 13C (Aldrich) a 1 g chloridu amonného 15N (Cambridge Isotope Laboratories, Inc.) pro značení proteinů izotopy.Snižte teplotu na 20 stupňů Celsia a vyvolejte expresi proteinu pomocí 0,15 mM isopropylthiogalaktopyranosidu (konečná koncentrace).Po expresi proteinu přes noc byly buňky sklizeny při 7278 x g, 4 °C po dobu 20 minut.Buněčné pelety byly resuspendovány ve 20 mM Tris-HCl, pH 8, a zmraženy do dalšího použití.Rozmražené buňky byly lyžovány za použití buněčného disruptoru (stroje řady TS, Constant Systems Limited, Anglie) při 30 kPa.Poté byly lyzáty centrifugovány při 25 000 g po dobu 30 minut při 4 °C.Pro NTMiSp byla peleta resuspendována ve 2 M močovině, 20 mM Tris-HCl, pH 8 a sonikována po dobu 2 minut (2 s zapnuto/vypnuto, 65 %), poté znovu odstředěna při 25 000 xg, 4 °C v rámci 30 min.Supernatant byl nanesen na kolonu Ni-NTA, promyt 20 mM Tris-HCl, 2 mM imidazolem, pH 8, a nakonec byl protein eluován 20 mM Tris-HCl, 200 mM imidazolem, pH 8. Pro vytvoření NT2RepCT a NTCT, štěpení trombinem zavádí místo (ThrCleav) mezi His a NT.Trombinová štěpná místa jsou také přítomna v His-NT-ThrCleav-2Rep (produkuje 2Rep), His-thioredoxin-ThrCleav-NT (produkuje NT), His-thioredoxin-ThrCleav-CT (produkuje CT), His-Thioredoxin-ThrCleav-NT .* (produkuje NT*), His-Thioredoxin-ThrCleav-NTA72R (produkuje NTA72R), His-Thioredoxin-ThrCleav-NTFlSp (produkuje NTF1Sp) a His-Sulphur Redoxin-ThrCleav-NTMiSp (produkuje NTMiSp).Konstrukty byly štěpeny trombinem (1:1000) a dialyzovány přes noc při 4 °C s 20 mM Tris-HCl, pH 8, za použití dialyzační membrány Spectra/Por s prahem molekulové hmotnosti 6-8 kDa.Po dialýze se roztok nanese na kolonu Ni-NTA a shromáždí se efluent obsahující sledovaný protein.Koncentrace proteinu byly stanoveny měřením UV absorbance při 280 nm s použitím extinkčního koeficientu každého proteinu, s výjimkou NTF1Sp, který používal Bradfordův test podle protokolu výrobce.Čistota byla stanovena elektroforézou na SDS polyakrylamidovém (4–20 %) gelu a barvením Coomassie brilantní modří.Proteiny byly koncentrovány pomocí centrifugačních filtrů (VivaSpin 20, GE Healthcare) při 4000 xg s 10 kDa molekulovou hmotností cutoff ve 20minutových cyklech.
Rozmrazte proteinový roztok a opatrně napipetujte 150 µl do 1 ml průhledné lahvičky se septem (8 x 40 mm Thermo Scientific).Zkumavky byly uzavřeny a utěsněny parafilmem, aby se zabránilo odpařování.Vzorky (n = 3) byly inkubovány při 37 °C nebo 60 °C a periodicky převraceny, aby se pozorovala gelovatění.Vzorky, které nezgelovatěly, byly inkubovány po dobu alespoň jednoho týdne.Snižte NTMiSp disulfidové vazby pomocí 10 mM DTT na 10 uM proteinu.Pro analýzu gelovatění potahů přírodního pavoučího hedvábí byl švédský můstkový pavouk odříznut, dvě hlavní ampulované žlázy byly umístěny do 200 ul 20 mM Tris-HCl pufru pH 8 a naříznuty, aby se povlak oddělil od žláz..Obsah žlázek se rozpustí v pufru, 50 ul pro stanovení suché hmotnosti (inkubací otevřených lahviček při 60 °C do konstantní hmotnosti) a 150 ul pro gelovatění při 37 °C.
Měřicí geometrie/nástroj je vyroben z nerezové oceli pomocí paralelní desky s horním průměrem 20 mm a mezerou 0,5 mm.Zahřejte vzorek z 25 °C na 45 °C a zpět na 25 °C rychlostí 1 °C za minutu pomocí Peltierovy desky se dnem z nerezové oceli.Vibrační měření byla prováděna při frekvenci 0,1 Hz a v lineární viskoelastické oblasti materiálu při napětí 5 % a 0,5 % pro vzorky 100 mg/ml a 300–500 mg/ml.Použijte vlastní vlhkostní komoru, abyste zabránili odpařování.Data byla analyzována pomocí Prism 9.
Pro sběr infračervených (IR) spekter při pokojové teplotě od 800 do 3900 cm–1.Zařízení ATR, stejně jako dráha světla přes spektrometr, se před a během experimentu propláchne suchým filtrovaným vzduchem.Na krystaly byly pipetovány roztoky (500 mg/ml pro minimalizaci píků absorpce vody ve spektrech) a gely (500 mg/ml) byly vytvořeny před měřením a poté přeneseny do krystalů (n = 3).Bylo zaznamenáno 1000 skenů s rozlišením 2 cm-1 a nulovým pracovním cyklem 2. Druhá derivace byla vypočtena pomocí OPUS (Bruker) s použitím vyhlazovacího rozsahu devíti bodů.Spektra byla normalizována na stejnou integrační oblast mezi 1720 a 1580 cm-1 pomocí F. Menges „Spectragryph – Optical Spectroscopy Software“.V ATR-IR spektroskopii je hloubka průniku infračerveného paprsku do vzorku závislá na vlnovém počtu, což má za následek silnější absorpci při nižších vlnových číslech než při vyšších vlnových číslech.Tyto účinky nebyly korigovány pro spektra znázorněná na Obr.3, protože jsou velmi malé (doplňkový obr. 4).Opravená spektra pro toto číslo byla vypočtena pomocí softwaru Bruker OPUS.
V zásadě je komplexní kvantifikace proteinových konformací možná po spolehlivé dekonvoluci složek v píku amidu I.V praxi se však objevují určité překážky.Šum ve spektru se může objevit jako (falešné) vrcholy během dekonvoluce.Kromě toho se pík v důsledku ohýbání vody shoduje s polohou píku amidu I a může mít podobnou velikost pro vzorky obsahující velké množství vody, jako je zde studovaný vodný gel.Proto jsme se nepokoušeli úplně rozložit vrchol amidu I a naše pozorování by měla být brána v úvahu pouze jako podpora jiných metod, jako je NMR spektroskopie.
Roztoky 50 mg/ml NT a His-NT2RepCT byly gelovány přes noc při 37 °C.Hydrogel byl poté zředěn 20 mM Tris-HCl (pH 8) na koncentraci 12,5 mg/ml, dobře protřepán a odpipetován, aby se gel rozbil.Dále byl hydrogel 10x zředěn 20 mM Tris-HCl (pH 8), 5 μl vzorku bylo naneseno na měděnou mřížku potaženou formvarem a přebytečný vzorek byl odstraněn savým papírem.Vzorky byly dvakrát promyty 5 ul vody MilliQ a barveny 1% uranylformiátem po dobu 5 minut.Odstraňte přebytečnou skvrnu savým papírem a poté síťku vysušte na vzduchu.Zobrazení bylo provedeno na těchto mřížkách pomocí FEI Tecnai 12 Spirit BioTWIN pracujícího při 100 kV.Obrázky byly zaznamenány při zvětšení x 26 500 a x 43 000 pomocí CCD kamery Veleta 2k x 2k (Olympus Soft Imaging Solutions, GmbH, Münster, Německo).Pro každý vzorek (n = 1) bylo zaznamenáno 10–15 snímků.ImageJ (https://imagej.nih.gov/) byl použit pro analýzu obrazu a měření průměrů vláken (n = 100, různá vlákna).Prism 9 byl použit k provádění nepárových t-testů (dvoustranných).Průměrné His-NT2RepCT a NT fibrily byly 11,43 (SD 2,035) a 7,67 (SD 1,389) nm, v daném pořadí.Interval spolehlivosti (95 %) je -4,246 až -3,275.stupně volnosti = 198, p < 0,0001.
80 ul kapalných vzorků obsahujících 10 uM thioflavin T (ThT) bylo měřeno v triplikátech (n = 3) za statických podmínek za použití Corning 96-jamkových destiček s černým dnem s čirým dnem (Corning Glass 3881, USA).Fluorescenční rozdíly byly zaznamenány pomocí 440 nm excitačního filtru a 480 nm emisního filtru (FLUOSTar Galaxy od BMG Labtech, Offenburg, Německo).ThT signál nebyl ani saturován, ani zhášen, protože experimenty s různými koncentracemi ThT byly prováděny beze změny intenzity signálu.Zaznamenejte absorbanci při 360 nm pro měření zákalu.Pro očkovací experimenty byly vytvořeny 100 mg/ml gely při 37 °C, resuspendovány a použity pro naočkování v molárních poměrech 5 %, 10 % a 20 %.Data byla analyzována pomocí Prism 9.
Rozmrazte zásobní roztoky His-NT2RepCT a NT >100 mg/ml na ledu a přefiltrujte přes 0,22 um filtr.Koncentrace byly vypočteny měřením absorbance při 280 nm pomocí Nanodrop.V jamkách 96jamkové černé nezávazné destičky (Corning) s čirým dnem byly vzorky zředěny na 20 mg/ml v 20 mM Tris-HCl pH 8 a smíchány s 5 μM ThT (konečná koncentrace), celková koncentrace vzorku objem 50 μl.Vzorky byly snímány každých 10 minut při 37 °C na mikroskopu CellObserver (Zeiss) s kanálem procházejícího světla a sadami FITC excitačních a emisních filtrů pro ThT zobrazení.Pro snímkování se používá čočka 20x/0,4.Pro analýzu obrazu byly použity Zen Blue (Zeiss) a ImageJ (https://imagej.nih.gov/).Gely byly také připraveny z roztoků NT a His-NT2RepCT v koncentraci 50 mg/ml obsahujících 20 mM Tris pH 8 a 5 uM ThT a inkubovány při 37 °C po dobu 90 minut.Kousky gelu byly přeneseny do nové jamky obsahující 20 mM Tris, pH 8 a 5 uM ThT v nevazebné černé 96jamkové destičce s čirým dnem.Pořizujte snímky zelené fluorescence a jasného pole při zvětšení 20x/0,4.ImageJ byl použit pro analýzu obrazu.
Spektra NMR v roztoku byla získána při 310 K na 600 MHz spektrometru Bruker Avance Neo vybaveném QCI Quadrupole Resonance Pulsed Gradient Field Cryoprobe (HFCN).NMR vzorky obsahující 10 mg/ml homogenního proteinu značeného 13C, 15N, rozpuštěného ve 20 mM Tris-HCl (pH 8), 0,02 % (w/v) NaN3, 5 % DO (v/v), (n = 1) .Chemické posuny NT2RepCT při pH 6,7 byly použity k přiřazení píku 23 ve 2D spektru 15N-HSQC.
Spektra NMR pevných látek s magickým úhlem rotace (MAS) hydrogelů značených 13C, 15N byla zaznamenána na spektrometru Bruker Avance III HD při 800 MHz vybaveném 3,2 mm 13C/15N{1H} bezelektronovou sondou.Teplota vzorku byla řízena pomocí proudu plynu s proměnlivou teplotou při 277 K. Spektra dvourozměrné dipólové rotační rezonance (DARR)76 a radiofrekvenčního přepojení (RFDR)77 byla získána při frekvencích MAS 12,5 kHz a 20 kHz.Křížová polarizace (CP) od 1H do 13C byla provedena pomocí lineární rampy od 60,0 do 48,0 kHz při 1H, 61,3/71,6 kHz při 13C (při 12,5/20 kHz MAS) a kontaktní době 0,5–1 ms.Během sběru dat bylo použito oddělení Spinal6478 na 73,5 kHz.Doba akvizice byla 10 milisekund a zpoždění cyklu bylo 2,5 sekundy.Jednovazné korelace Ca/Cp pozorované ve spektrech RFDR byly přiřazeny na základě charakteristických chemických posunů typu zbytků a vícenásobně spojených korelací ve spektrech DARR.
Databáze Zipper79 (https://services.mbi.ucla.edu/zipperdb/) byla použita k vyhodnocení tendencí flutteru a energie Rosetta pro NT, NTFlSp a NTMiSp.Databáze Zipper počítá Rosetta Energy80, která kombinuje několik funkcí volné energie k modelování a analýze proteinové struktury.Energetická hladina -23 kcal/mol nebo nižší ukazuje na vysokou tendenci k fibrilaci.Nižší energie znamená větší stabilitu dvou β-pramenů v uspořádání zipu.Algoritmus Waltz byl navíc použit k predikci amyloidogenních oblastí v NT, NTFlSp a NTMiSp Ref.81. (https://waltz.switchlab.org/).
Roztok NT proteinu byl smíchán s pufrem 2-(N-morfolino)ethansulfonové kyseliny (MES) při pH 5,5 a 6,0 pro snížení pH na pH 6 a 7, v daném pořadí.Konečná koncentrace proteinu byla 100 mg/ml.
Měření byla provedena na spektrometru J-1500 CD (JASCO, USA) pomocí 300 μl kyvety s optickou dráhou 0,1 cm.Proteiny byly zředěny na 10 uM (n = 1) v 20 mM fosfátovém pufru (pH 8).Pro analýzu stability proteinu v přítomnosti soli byly proteiny analyzovány ve stejné koncentraci (n = 1) ve 20 mM fosfátovém pufru (pH 8) obsahujícím 154 mM NaF nebo NaCl, v daném pořadí.Teplotní skeny byly zaznamenávány při 222 nm od 25 °C do 95 °C s rychlostí zahřívání 1 °C/min.Podíl nativně složených proteinů byl vypočten pomocí vzorce (KDmeasure – KDfinal)/(KDstart – KDfinal).Kromě toho bylo pro každý vzorek zaznamenáno pět spekter od 260 nm do 190 nm při 25 °C a po zahřátí na 95 °C.Pět spekter bylo zprůměrováno, vyhlazeno a převedeno na molární elipticitu.Data byla analyzována pomocí Prism 9.
Intenzita fluorescence His-NT-GFP (300 mg/ml, 80 ul) byla měřena v triplikátech (n = 3) v 96jamkových destičkách Corning s černým průhledným dnem (Corning Glass 3881, USA) za statických podmínek.Vzorky změřte pomocí čtečky destiček na bázi fluorescence s excitační vlnovou délkou 395 nm a zaznamenejte emisi při 509 nm před gelovatěním a o 2 hodiny později při 37 °C.Data byla analyzována pomocí Prism 9.
Souprava pro stanovení aktivity purinové nukleosidové fosforylázy (fluorometrická metoda, Sigma Aldrich) byla použita podle pokynů výrobce.Pro měření aktivity v gelech a roztocích obsahujících His-NT-PNP smíchejte 10 ng His-NT-PNP se 100 mg/ml NT na celkový objem 2 µl, protože gel poskytoval signál nad detekčním intervalem sady.Byly zahrnuty kontroly pro gely a roztoky bez His-NT-PNP.Měření byla provedena dvakrát (n = 2).Po změření aktivity byla reakční směs odstraněna a gel byl vyfotografován, aby se zajistilo, že gel zůstane během měření neporušený.Data byla analyzována pomocí Prism 9.
Další informace o designu studie najdete v abstraktu studie Nature, který je připojen k tomuto článku.
Obrázky 1 a 2 představují výchozí data.1c, 2a–c, 3a, b, e–g, 4, 5b, d, f a 6, doplňkové obr.3, doplňkový Obr.5a, d, doplňkový Obr.6 a doplňkový Obr.8. Data Data z této studie jsou umístěna v databázi Zenodo https://doi.org/10.5281/zenodo.6683653.NMR data získaná v této studii byla odeslána do úložiště BMRBig pod položkou ID bmrbig36.Struktury GFP a PNP byly převzaty z PDB (GFP 2B3Q, PNP 4RJ2).
Rising, A. a Johansson, J. Spinning umělé pavoučí hedvábí.National Chemical.biologie.11, 309–315 (2015).
Babb, PL a kol.Genom Nephila clavipes zdůrazňuje rozmanitost genů pavoučího hedvábí a jejich komplexní expresi.Národní Genette.49, 895–903 (2017).