347 chemická součást spirálové trubky z nerezové oceli, Identifikace nových chaperonových proteinů lidského leukocytárního antigenu-A (HLA-A) reagujících na interferon pomocí zesíťované hmotnostní spektrometrie (CLMS)

Děkujeme, že jste navštívili Nature.com.Používáte verzi prohlížeče s omezenou podporou CSS.Chcete-li dosáhnout nejlepšího výsledku, doporučujeme použít aktualizovaný prohlížeč (nebo vypnout režim kompatibility v aplikaci Internet Explorer).Abychom zajistili trvalou podporu, zobrazujeme web bez stylů a JavaScriptu.
Posuvníky zobrazující tři články na snímku.Pro pohyb mezi snímky použijte tlačítka zpět a další, pro pohyb po jednotlivých snímcích použijte tlačítka posuvného ovladače na konci.

Popis výrobku

Trubky z nerezové oceli 347L, jakost oceli: SS347L

Interferonový signalizační systém indukuje silnou cytokinovou odpověď na širokou škálu patogenních a vnitřních patologických signálů z prostředí, což vede k indukci podskupin interferonem indukovatelných proteinů.Použili jsme DSS zprostředkovanou křížovou hmotnostní spektrometrii (CLMS) k detekci nových interakcí protein-protein v doméně proteinů indukovaných interferonem.Kromě očekávaných proteinů indukovatelných interferonem jsme také identifikovali nové intermolekulární a intramolekulární zesíťované adukty kanonických proteinů indukovatelných interferonem, jako jsou MX1, USP18, OAS3 a STAT1.Zaměřili jsme se na ortogonální validaci nového souboru interferonem indukovatelných proteinových sítí tvořených HLA-A proteiny (H2BFS-HLA-A-HMGA1) pomocí koimunoprecipitace a jejich další studium pomocí modelování molekulární dynamiky.Modelování konformační dynamiky proteinového komplexu odhalilo několik interakčních míst, která odrážela interakce identifikované v nálezech CLMS.Společně představujeme pilotní studii CLMS k identifikaci nových signálních komplexů indukovaných interferonem a těšíme se na širší využití CLMS k identifikaci nové dynamiky proteinových interakcí v mikroprostředí nádoru.
Než začne adaptivní imunitní reakce, vrozený obranný systém hostitele spustí antimikrobiální reakci zprostředkovanou rodinou vylučovaných alfa-helikálních cytokinů nazývaných interferony (IFN).Třídy IFN typu I IFNa a IFNp aktivují buněčné odpovědi, včetně antivirových, proapoptotických, prozánětlivých a antiproliferativních stavů.U lidí je známo 13 podtypů IFNa, všechny seskupené na chromozomu 91. Překvapivě byl pro klinické použití studován pouze IFNa2.V poslední době je zvláštní pozornost věnována výzkumu dalších subtypů IFNα.Nedávná studie ukázala, že IFNa14 je jednou z nejúčinnějších izoforem při omezování replikace HBV2 a HIV-13,4 ve srovnání s kanonickým podtypem IFNa2.
Bylo zjištěno, že aktivované komplexy receptoru interferonu typu I (IFNAR1 a IFNAR2) spouštějí kaskádu přenosu signálu zprostředkovanou Janusovými kinázami TYK2 a JAK15,6.Tyto Janusovy kinázy fosforylují signální převodníky a aktivátory transkripčních proteinů (STAT1 a STAT2) na tyrosinových zbytcích, aby zahájily heterodimerizaci zprostředkovanou doménou SH26.Následně IRF9 váže heterodimery STAT za vzniku trimerního komplexu genu faktoru 3 stimulovaného IFN (ISGF3), který se translokuje do jádra a indukuje transkripci více než 2000 genů stimulovaných interferonem (ISG)5,6,7,8.
ISG tvoří páteř vrozeného imunitního systému, zejména v reakci na virový útok.Jako první obrannou linii proti virové infekci buňky rychle využívají rozsáhlé interakce buněčných proteinů se širokým spektrem biologických aktivit.Tyto proteiny zahrnují receptory pro rozpoznávání vzorů, signální molekuly, transkripční faktory a proteiny s přímou antivirovou funkcí a také negativní regulátory imunitních odpovědí9.Velká část informací o aktivitě ISG pochází z funkčních screeningů pomocí screeningů nadměrné exprese10,11 nebo technik umlčování genů (siRNA, RNAi a CRISPR)12,13 při kterých jsou jednotlivé ISG exprimovány nebo inhibovány a jejich aktivita je testována na různých virech.Ačkoli tyto studie určily antivirové vlastnosti jednotlivých ISG, základní molekulární mechanismy každého ISG zůstávají do značné míry neznámé.Obecně se uznává, že mnoho proteinů interaguje s jedním nebo více cytokiny, aby byla zajištěna plná aktivita, takže buď ISG interagují přímo, nebo jsou jejich interakce zprostředkovány buněčnými proteiny.Například nedávná fotosíťovaná proteomická studie identifikovala ATPázu VCP/p97 jako hlavního IFITM3 interakčního partnera, jehož inhibice vede k defektům v lysozomálním třídění, obratu a společném transportu IFITM3 s virovými částicemi 14 .Pomocí imunoprecipitace jsme identifikovali VAPA, protein asociovaný s vezikuly, jako interakčního partnera s IFITM1/2/3, který zprostředkovává cholesterolem zprostředkované zrání viru, a to bylo potvrzeno další studií využívající kvasinkový dvouhybridní systém.Vědecká podpora 15 , 16 .
Základním biologickým procesem zapojeným do potlačení infekce a maligní transformace je prezentace antigenu, která je zprostředkována molekulami hlavního histokompatibilního komplexu (MHC).Peptidy (8-12 aminokyselin dlouhé) z odštěpených, předčasně ukončených nebo chybně poskládaných proteinů jsou vloženy do MHC-I heterodimeru (skládajícího se z MHC-I těžkých a lehkých řetězců, nazývaných β-2-mikroglobulin; β2M)17,18.Výsledné stabilní trimery MHC-I jsou transportovány na buněčný povrch, kde prezentují intracelulární peptidy CD8+ T buňkám (cytotoxické T buňky)17.T buňky rozpoznávají a ničí tyto patogeny a buňky nesoucí nádorově specifický antigen.V důsledku toho patogeny a nádorové buňky často potlačují proces prezentace antigenu, aby se vyhnuly imunitnímu dozoru.Kromě toho je MHC-I downregulován u 40–90 % lidských nádorů a je často spojen s horší prognózou19.
Geny zapojené do reakce na patogeny se musí rychle přepínat mezi klidovým stavem a stavem aktivní transkripce.Proto se předpokládá, že několik buněčných proteinů se podílí na reakci na vysokou poptávku po IFN během krátkých časových období, včetně remodelace a modifikace promotorového chromatinu20,21.Většina studií se zaměřila na identifikaci jednotlivých ISG proteinových partnerů v přítomnosti IFN.Několik proteomických a transkriptomických studií v modelových buněčných systémech objasnilo účinek IFN na buněčnou krajinu.Navzdory rostoucímu chápání dynamiky indukované interferony však stále víme málo o zapojení ISG.Při zvažování složitosti a časově závislé dynamiky interferonové signalizace vyvstávají dvě otázky: (i) je možné stabilizovat a zachytit multiproteinové komplexy zapojené do rychlé signalizace a (ii) lze tyto interakce mapovat do 3D prostoru?
Abychom tyto problémy vyřešili, implementovali jsme chemické křížové zesíťování zprostředkované disukcinimidem suberátem (DSS) spojené s hmotnostní spektrometrií (CLMS), abychom studovali síť interakcí proteinů indukovaných IFNa a její dynamiku.DSS přidává kovalentní vazby mezi proximální zbytky proteinů a/nebo proteinové komplexy in vivo.Následná MS analýza odhaluje specifická síťovací místa, která odrážejí prostorovou blízkost oblastí v konkrétním proteinu, nazývané vnitřní vazby nebo podjednotky v proteinových komplexech, nazývané vzájemné vztahy.Pomocí tohoto přístupu jsme identifikovali několik nových protein-proteinových komplexů a také interferonem indukované multiproteinové interakční sítě.Dalším testováním podmnožiny těchto nových interakcí prokazujeme, že H2BFS (FS histonového typu H2B; dále jen H2B) a MDN1 působí jako vazební partneři pro HLA-A.
Flo-1 buňky jsou jedním z nejznámějších in vitro modelů adenokarcinomu jícnu, protože napodobují klíčové rysy nádorů jícnu22,23.Ne všechny nádory jsou však imunogenní a abychom určili, zda buňky Flo-1 reagují na léčbu interferonem, ošetřili jsme buňky Flo-1 10 ng/ml IFNa po dobu 72 hodin.Flo-1 buňky vykazovaly časnou indukci pSTAT1 a IRF1, začínající 2 hodiny po ošetření a pokračující 72 hodin, s časově závislým poklesem stacionárních hladin IRF1 (obrázek 1A).Bylo zjištěno, že ISG (MX1, IFITM1, OAS1/2 a ISG15) jsou silně indukovány po 6 hodinách, což napodobuje klasické reakce střední a pozdní fáze na IFNa (obrázek 1A).Společně tato data naznačují, že tento buněčný model lze použít ke studiu interferonových odpovědí.
Odpovědi exprese diferenciálního proteinu v buňkách Flo-1 po ošetření IFNa.(A) Exprese proteinu v buňkách Flo-1 ošetřených 10 ng/ml IFNa po dobu 2, 6, 24, 48 a 72 hodin byla analyzována imunoblotem s použitím uvedených ISG protilátek.(B) Gely SDS-PAGE obarvené Coomassie modří extraktů celých buněk po zesíťování s DSS pro uvedené časy a koncentrace.(C) Reprezentativní imunoblot vyšetřený s protilátkou p53(DO-1) ze stejných vzorků pro hodnocení stupně zesítění proteinu.
K zachycení prostředí proteinových interakcí in situ jsme použili DSS, široce používané síťovací činidlo díky své vysoké membránové permeabilitě a relativně krátké reakční době.Kratší reakční doba pomáhá předcházet tvorbě velkých agregátů zesíťovaných proteinů, čímž se udržuje stabilita zesíťovacího činidla.Abychom určili optimální koncentraci DSS a zabránili nadměrnému zesítění, nejprve jsme buňky vystavili 5, 2,5 a 1 mM DSS po dobu 5, 10, 5 a 30 minut, v daném pořadí, a analyzovali jsme lyzáty pomocí SDS-PAGE barveného Coomassie. (data nejsou uvedena) .Buněčné lyzáty se zdají být vysoce zesíťované při nejnižší koncentraci a v nejkratším časovém bodě.Proto byl DSS titrován na 1, 0,5 a 0,1 mM během 5 minut (obrázek 1B).Optimální zesítění bylo pozorováno s 0,5 mM DSS po dobu 5 minut a tyto podmínky byly zvoleny pro buňky ošetřené IFNa.Kromě toho obrázek 1C ukazuje Western blot prováděný s použitím protilátky p53 (DO-1) pro hodnocení stupně zesítění proteinu.
Flo-1 buňky byly ošetřeny 10 ng/ml IFNa po dobu 24 hodin před přidáním síťovacího činidla.Zesíťované buňky byly následně lyžovány dvoustupňovou proteolýzou a proteiny byly zpracovány pomocí FASP (obr. 2)24,25.Zesítěné tryptické peptidy byly analyzovány hmotnostní spektrometrií (obr. 2).Spektra MS/MS jsou poté porovnána s proteinovou sekvencí a kvantifikována pomocí MaxQuant26,27.Ze získaných spekter byly identifikovány zesíťované peptidy pomocí programu SIM-XL a jednotlivé sloučeniny byly zkombinovány do komplexní sítě pomocí open source počítačových softwarových pipelines xQuest28 a SIM-XL29 (obr. 2).SIM-XL identifikuje protein-proteinové interakce, vnitřní řetězce a jednotlivé řetězce v jednoduchých nebo komplexních proteinových směsích a poskytuje skripty pro vizualizaci interakcí v proteinových strukturách.Kromě toho řadí každý křížový odkaz jako ID skóre podle kvality spektra MS/MS29.Bylo identifikováno několik vysoce spolehlivých interakcí a komplexů protein-protein a nový soubor interakcí byl dále zkoumán pomocí koimunoprecipitace a konformačních změn komplexů pomocí modelování molekulární dynamiky (obr. 2) 30, 31.
Schematický přehled metody CLMS.Flo-1 buňky byly ošetřeny 10 ng/ml IFNa po dobu 24 hodin, následovalo in situ proteinové zesíťování pomocí DSS s následnou lýzou buněk a trypsinizací.Zesíťované vzorky byly analyzovány pomocí hmotnostního spektrometru Orbitrap a dále byly odebrány vzorky pro fragmentaci peptidových prekurzorů během LC-MS/MS.Ze získaných spekter byly identifikovány dva spojené peptidy pomocí programu Spectrum Recognition Machine programu Crosslinked Peptides (SIM-XL) a všechny sloučeniny byly zkombinovány do komplexní sítě pomocí výpočetních potrubí.Odfiltrujte interakce s nízkou spolehlivostí na základě skóre falešně pozitivních výsledků (FDR).Několik nových vysoce věrných interakcí protein-protein bylo dále potvrzeno pomocí koimunoprecipitace a konformační změny v komplexech byly zkoumány pomocí modelování molekulární dynamiky (MD).
Celkem -30 500 a -28 500 peptidů bylo detekováno pomocí MaxQuant v nestimulovaných, respektive stimulovaných vzorcích IFNa (doplňková tabulka S1, obr. 3A).Distribuce délky peptidu v obou případech ukázala vyšší podíl větších peptidů, což ukazuje na přítomnost zesíťovaných peptidů (obr. 3B,C).Kromě toho byl ve vzorcích ošetřených IFNα přítomen větší podíl větších peptidů v rozmezí 40–55 (obr. 3C).Mapování proteinů proti intenzitě log2 ukázalo, že klasické proteiny stimulované interferonem byly nejhojnější ve srovnání s neošetřenými vzorky, včetně MX1, IFIT1/3, OAS2/3, DDX58 a HLA-F (obrázek 3D).Analýza drah pro proteiny více než trojnásobně obohacené v reakci na léčbu IFNa pomocí databáze cest Reactome ukázala, že prezentace a zpracování antigenu zprostředkované MHC-I byly nejdominantnější cestou (obrázek 3E).V souladu s dřívějšími zprávami patřily mezi aktivované dráhy antivirové odpovědi zprostředkované OAS a ISG15, stejně jako IFNα/β a cytokinová signalizace.Kromě toho byly z původně získaných MS/MS spekter pomocí SIM-XL identifikovány proteinové křížové vazby specifické pro lysin a serin.Nedávná studie uváděla 104 ISG zahrnujících 20 virů z 9 tříd virů metaanalýzou jednotlivých studií nadměrné exprese ISG v 5 buněčných typech9.Abychom však překonali výpočetní omezení screeningu velkých souborů dat, začali jsme s menším souborem dat, abychom prozkoumali možné interakce mezi seznamem genů IRDS, který uvádí Padaria et al., z nichž většina jsou ISG.
Identifikace odlišně exprimovaných zesíťovaných proteinů v reakci na IFNa (data získaná z MaxQuant).(A) Vennův diagram představující počet běžných a exkluzivních peptidů identifikovaných ve vzorcích Flo-1 ošetřených IFNa14 a neošetřených vzorcích.Distribuce délky peptidu neošetřených (B) a IFNa ošetřených (C) zesíťovaných vzorků.(D) Tepelná mapa představující log2 (intenzita LFQ) mezi neošetřenými a IFNa14 ošetřenými Flo-1 buňkami.Levý panel ukazuje proteiny nejaktivněji aktivované v přítomnosti IFNa.(E) Histogram představující 20 hlavních drah obohacení po léčbě IFNa.Databáze Reactome pathway analyzovala více než čtyřnásobné změny v upregulovaných IFNa-responzivních proteinech.
Interferonem zprostředkovaná ISG stimulace je dobře zdokumentována, ale na molekulární úrovni je špatně pochopeno, jak tyto proteiny kulminují v široké škále biologických funkcí.Zkoumali jsme proteinové interakce s vysokou mírou spolehlivosti mezi známými ISG.Je zajímavé, že jsme identifikovali síť zahrnující proteiny MX1, USP18, ROBO1, OAS3 a STAT1, které tvoří velký komplex v reakci na léčbu IFNa (obrázek 4, tabulka S2) 32,33,34.Nejdůležitější je, že tyto interakce byly nalezeny ve všech triplikátech ošetřených IFNa a nebyly nalezeny v neošetřených vzorcích, což naznačuje, že byly vytvořeny specificky v reakci na léčbu IFNa.Je známo, že STAT1 transkripčně reguluje expresi těchto ISG, ale jeho interakce s ISG na proteinové úrovni nebyla studována.Krystalová struktura STAT1 ukázala, že jeho helikální doména (CCD) není zapojena do interakce s DNA nebo protomery během tvorby dimerů35.Tyto a-helixy tvoří helikální helixovou strukturu, která poskytuje převážně hydrofilní povrch pro interakce, ke kterým dochází35.V našich datech CLMS jsme pozorovali, že většina interakcí s STAT1 se vyskytla v doméně SH2 předcházející CCD, doméně linkeru nebo C-terminálním konci (zbytky 700-708) (obrázek 4A).Předchozí studie uvedla, že USP18 se váže na CCD a DNA-binding domain (DBD) STAT2 a je rekrutován do podjednotky receptoru interferonu typu I IFNAR2, aby zprostředkovával inhibici signalizace interferonu typu I24.Naše data také ukázala, že katalytická doména USP18 interaguje s STAT1 DBD (obrázek 4A, D), což naznačuje, že jak STAT1, tak STAT2 mohou hrát roli při přitahování USP18 k IFNAR2.
Síť protein-protein ISG identifikovaná v zesíťovaných buňkách ošetřených IFNa.(A) 2D graf interakcí ukazující interakce protein-protein (vytvořený v programu SIM-XL), s čarami představujícími intermolekulární interakce (mezní hodnota crosslinku nastavena na 3,5).Domény různých identit jsou označeny svou barvou32: doména MX1, Dynamin_N (73–249), Dynamin_M (259–547) a GED (569–660).Domény OAS3: OAS1_C (160-344), OAS1_C (559-745), NTP_transf_2 (780-872) a OAS1_C (903-108).Doména ROBO1, Ig_3 (67–151), I-set (170–258), I-set (262–347), Ig_3 (350–432), Ig_3 (454–529), fn3 (562–646), fn3 (678–758) a fn3 (777–864).Pole STAT1: STAT_int (2–120), STAT_alpha (143–309), STAT_bind (321–458), SH2 (573–657) a STAT1_TAZ2bind (715–739).(B) Kruhový prohlížeč zesíťovaných proteinů (MX1, UBP18, OAS3, ROBO1 a STAT1) s interakcemi a interakcemi označenými modře a červeně.Prahová hodnota zesítění byla stanovena na 3,5.Bodové grafy ukazují interakční místa STAT1 s MX1 (C), USP18 (D), ROBO1 (E) a OAS3 (F), stejně jako místa interakce K nebo S mezi těmito dvěma peptidy.Na obrázku je práh skóre zesítění nastaven na 3,0.(G) Různá interakční místa mezi doménami STAT1 a OAS3 DI superponovaná na jejich proteinových strukturách v PyMol (systém molekulární grafiky PyMOL, verze 2.0 Schrödinger, LLC.);STAT1 (pdb id: 1bf533) a OAS3 (pdb id: 4s3n34).) program.
U lidí byly popsány dvě izoformy USP18, protein plné délky, který je převážně lokalizován v jádře, a izoforma bez N-terminální domény, USP18-sf, která je rovnoměrně distribuována v cytoplazmě a jádře36.Kromě toho bylo předpovězeno, že N-konec je nestrukturovaný a nevyžaduje aktivitu izopeptidázy nebo vazbu ISG1537.Většina interakcí identifikovaných v naší studii byla lokalizována na N-konci proteinu, což naznačuje, že tyto interakce zahrnují USP18 v plné délce (obrázek 4A, D), a proto se pravděpodobně vyskytují v jádře.Navíc naše data také naznačují, že N-konec je specializovaný na interakce protein-protein.Vazebné místo IFNAR2 se nachází mezi zbytky 312-368 a zejména se žádný z proteinů v komplexu neváže na tuto oblast (obr. 4A)37,38.Tato data společně ukazují, že IFNAR2 vazebná doména je výhradně používána receptorovým proteinem.Kromě toho bylo zjištěno, že pouze OAS3 a ROBO1 jsou spojeny s doménami upstream od N-konce a vazebného místa IFNAR2 (obrázek 4A).
ROBO1 patří do imunoglobulinové (Ig) superrodiny transmembránových signálních molekul a skládá se z pěti Ig domén a tří fibronektinových (Fn) domén v extracelulární oblasti.Po těchto extracelulárních doménách následuje membránová proximální oblast a jediná transmembránová šroubovice 39. Nestrukturovaná intracelulární oblast se nachází na C-konci a obsahuje konzervované sekvenční motivy, které zprostředkovávají vazbu efektorového proteinu39.Oblast sahající od aminokyselin ~1100 do 1600 je většinou neuspořádaná.Zjistili jsme, že MX1 interaguje s ROBO1 prostřednictvím Ig, Fn a intracelulárních domén, zatímco většina interakcí se STAT1 se vyskytuje mezi jeho CCD, linkerovou doménou a C-koncem ROBO1 (obr. 4A,E).Na druhou stranu, interakce s DI, DIII a OAS3 linkerovými oblastmi byly distribuovány v proteinu ROBO1 (obr. 4A).
Rodina proteinů oligoadenylátsyntázy (OAS) přijímá a váže intracelulární dvouvláknovou RNA (dsRNA), podléhá konformačním změnám a syntetizuje 2',5'-vázané oligoadenyláty (2-5 As)40.Bylo zjištěno, že ze tří OAS vykazuje OAS3 nejvyšší afinitu k dsRNA a syntetizuje nejmenší množství 2-5 As, které mohou aktivovat RNázu L a tím omezit replikaci viru41.Rodina OAS se skládá z nukleotidových transferázových domén podobných polymeráze beta (pol-β).Předchozí výzkum ukázal, že katalytická aktivita C-terminální domény (DIII) je závislá na dsRNA-vazebné doméně (DI), která je nutná pro aktivaci OAS342.Pozorovali jsme, že DI a DII domény OAS3 interagují s CCD a malou spojovací oblastí mezi SH2 a STAT1 TAD (obrázek 4A,F).Překrytí různých síťovacích míst na proteinové struktuře odhalilo interakci mezi β-listem a smyčkou DBD STAT1 a otevřenou kapsu nebo dutinu tvořenou zbytky 60–75 v doméně DI OAS3 (obr. 4G).Orientace proteinů v komplexu také ukázala, že žádná z interakcí s OAS3 nenarušila schopnost vázat DNA jeho domény DI (obr. S1A).Navíc N-terminální doména GTPázy MX1 intenzivně interaguje s DI a DIII doménami OAS3 (obr. 4A).Pozorovali jsme také interakci mezi OAS1 a MX1 ve všech třech opakováních ošetřených IFNa, kde jedna doména OAS1 (také katalyticky aktivní) interagovala se všemi třemi doménami MX1 (obrázek S2A, B).
MX proteiny jsou součástí velké rodiny GTPáz podobných dyneinu, které obsahují N-koncovou doménu GTPázy, která váže a hydrolyzuje GTP, intermediární doménu, která zprostředkovává samosestavení, a C-koncový leucinový zip, který působí jako GTPáza (LZ ).doména efektorová doména25,43.MX1 se váže na podjednotky virových polymeráz a blokuje transkripci virového genu43.Dříve publikovaný kvasinkový dvouhybridní screening ukázal, že MX1 spojený s PIAS1 inhibuje aktivaci genu zprostředkovanou STAT1 blokováním vazebné aktivity DNA a má také aktivitu ligázy SUMO E344,45.Zde prokazujeme, že MX1 se váže na STAT1 (obrázek 4C, D), avšak jak tato interakce ovlivňuje aktivaci genu zprostředkovanou STAT1 v reakci na IFNa, potřebuje další studii.Kromě toho jsme také zjistili, že MX1 interagoval s IFIT3 a DDX60 ve všech třech opakováních ošetřených IFNa (obr. S2C).
DDX60 je IFN-indukovaná cytoplazmatická helikáza, o které bylo dříve uvedeno, že hraje roli v RIG-I-nezávislé degradaci virové RNA46.Interaguje s RIG-I a aktivuje svou signalizaci ligandově specifickým způsobem 46. DDX60 se skládá z helikázové domény DEXD/H-Box a C-terminální helikázové domény, které vážou virovou RNA a DNA47.Většina jeho interakcí s MX1 a IFIT3 se vyskytuje v dlouhých N- a C-terminálních oblastech bez kanonických domén nebo motivů (obr. S2E, F).MX1 je však také spojen s helikázovou doménou DEXD/H-Box (obr. S2E).Proteiny rodiny IFIT mají tandemové kopie charakteristického motivu helix-turn-helix nazývaného tetrapeptidová repetice (TPR).Bylo zjištěno, že IFIT3 je pozitivní modulátor signalizace RIG-I, a tedy složka komplexu MAVS.Celkově vzato, naše data naznačují, že IFIT3 a DDX60 interagují především v oblasti mezi TPR 3–6 IFIT3 a mohou hrát roli v signalizaci RIG-I/MAVS (obr. S2F).
Vzhledem k tomu, že screening celého proteomu je výpočetně náročný, pak jsme provedli screening celé lidské databáze UniProt na přítomnost jedné z repetic ošetřených IFNa.V této replice jsme našli několik vysoce spolehlivých interakčních sítí pro HLA-A.Analýza proteinových drah identifikovaných pomocí MS/MS spekter ukázala, že zpracování a prezentace antigenu na bázi MHC-I je hlavní cestou indukovanou interferonem (obr. 3D).Proto jsme se zaměřili na studium proteinových interakcí molekul MHC-I s vysokou mírou spolehlivosti ve všech zesíťovaných vzorcích.HLA se skládá z domén α1, α2 a α3 a lehkých řetězců a mikroglobulin β2 (β2m) je konstantní chaperonový protein49.Po sestavení v endoplazmatickém retikulu je HLA v nepřítomnosti peptidových ligandů nestabilní50.Peptid-vazebná drážka je tvořena vysoce polymorfními a nestrukturovanými doménami α1 a α2 v nepeptidové formě a relativně méně polymorfní doménou α351.V přítomnosti IFNα jsme detekovali dva komplexy HLA-A: jeden interaguje s HMGA1 a H2B (obrázek 5, tabulka S3) a druhý interaguje s MDN1, LRCH4 a H2B (obrázek 6).
IFNα indukuje HLA-A interakční síť s H2B (H2BFS) a HMGA1.(A) 2D graf (vygenerovaný v softwaru SIM-XL) zobrazující různé typy interakcí v komplexu H2B-HLA-A-HMGA1: propojení (modrá), propojení (červená) a jednoduchá vazba (černá)..Domény různých identit jsou barevně kódovány32: H2B (histon; 2–102) a MHC-I (MHC_1; 25–203, skupina C1; 210–290 a MHC_I_C; 337–364).Prahová hodnota zesítění byla stanovena na 3,5.Bodové grafy ukazují místa interakce HLA-A s H2B (B) a HMGA1 (C), stejně jako místa interakce K nebo S mezi těmito dvěma peptidy.Na obrázku je práh skóre zesítění nastaven na 3,0.(D) Vztahy mezi proteiny zobrazenými ve strukturách proteinů H2B, HLA-A a HMGA1 v programu PyMOL.Tyto struktury byly modelovány pomocí serveru Phyre2 (http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/phyre2) a templátové struktury pro proteiny H2B, HLA-A a HMGA1 byly 1kx552, 1kj349 a 2eze55, v daném pořadí.
IFNα indukuje HLA-A interakční síť s H2B (H2BFS), MDN1 a LRCH4.(A) Intramolekulární (červená) a intermolekulární (modrá) příčné vazby prezentované na 2D interaktivní mapě (vygenerované v softwaru SIM-XL) s MDN1 znázorněným jako kruh.Prahová hodnota zesítění byla stanovena na 3,5.Domény různých identit jsou barevně kódovány32: H2B (histon; 2–102), MHC-I (MHC_1; 25–203, skupina C1; 210–290 a MHC_I_C; 337–364) a LRCH4 (LRR_8 (68–126), LRR_8 (137–194) a CH (535–641)).(B) Vztahy mezi proteiny zobrazenými ve strukturách proteinů H2B, HLA-A, LRCH4 a MDN1 v programu PyMOL.Tyto struktury byly modelovány pomocí serveru Phyre2 (http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/phyre2) s templátovými strukturami 1kx552, 1kj349, 6hlu62 a 6i2665 pro proteiny H2B, HLA-A, LRCH4 a MDN1, respektive.Bodové grafy ukazující místa interakce K nebo S pro HLA-A s H2B (C), LRCH4 (D) a MDN1 (E).Pro grafy byl práh skóre zesítění nastaven na 3,0.
Histon H2B se kromě zachování integrity genomu podílí také na regulaci transkripce.Protein H2B se skládá z centrální histonové domény (HFD) tvořené třemi a-helixy oddělenými smyčkami a C-terminálním koncem 41,52.Většina interakce s H2B se vyskytuje ve šroubovici α1, která zajišťuje trimerizaci s heterodimerem HFD (obr. 5A,B).Ačkoli se lysiny podílejí na vazbě DNA, některé lysiny jsou také alternativními acetylačními nebo methylačními místy.Například zbytky K43, K46 a K57 z H2B se nepodílejí na přímé vazbě DNA, ale jsou cíli různých post-transkripčních modifikací53.Podobně zbytky K44, K47 a K57 v H2B mohou hrát alternativní roli v přítomnosti IFNa, včetně interakcí s jinými proteiny (obr. 5A, B).Extrachromozomální histon H2B navíc aktivuje imunitní odpověď v různých typech buněk a působí jako cytosolový senzor pro detekci fragmentů dvouvláknové DNA (dsDNA) odvozených z infekčních agens nebo poškozených buněk54.V přítomnosti DNA virů deplece H2B inhibovala produkci IFN-β a fosforylaci STAT154.Je také známo, že H2B se pohybuje dovnitř a ven z jádra rychleji než jiné jádrové histony54.Ve vybraných neošetřených vzorcích byly také pozorovány interakce H2B s MDN1 a LRCH4.Zjistili jsme, že HLA-A interagoval s H2B ve všech třech vzorcích ošetřených IFNa a v jednom neošetřeném opakovaném vzorku.Tato data odrážejí roli H2B v alternativní fyziologické funkci nezávislé na transkripční regulaci.
HMGA1 (skupina s vysokou mobilitou AT-Hook 1), malý nukleoprotein bohatý na aminokyseliny podporující onemocnění, byl identifikován ve spojení s HLA-A.Má kyselý C-terminální konec a tři odlišné DBD nazývané AT háčky, protože se vážou na menší žlábek oblasti bohaté na AT v dsDNA55,56.Tato vazba způsobuje, že se DNA ohýbá nebo narovnává, což umožňuje kanonickým transkripčním faktorům přístup ke své konsenzuální sekvenci.Předpokládá se, že C-koncový konec je zapojen do interakcí protein-protein a náboru transkripčních faktorů, protože mutanti s C-koncovou delecí nejsou schopni zahájit transkripci57.Navíc tato doména obsahuje několik konzervovaných fosforylačních míst, která jsou známými substráty pro kinázy58.Pozorovali jsme interakce HLA-A a H2B s HMGA1 mimo C-terminální doménu, což naznačuje, že C-terminální doména se používá hlavně pro vazbu transkripčního faktoru (obr. 5A, C).Proteiny HMGA soutěží s histonem H1 o vazbu na adaptorovou DNA, čímž se zvyšuje dostupnost57.Podobně se zdá pravděpodobné, že HMGA interaguje s histonem H2B podél linkerové DNA v konkurenci s histonem H1.HMGB1 indukuje expresi HLA-A, -B a -C v dendritických buňkách, což vede k jejich aktivaci59, ale interakce mezi HMG a HLA nebyla dříve popsána.Zjistili jsme, že HMGA1 interaguje s doménami α1 a α3 HLA-A, přičemž většina interakcí je mimo jeho 3 DBD (obrázek 5A,C).V našich rukou bylo zjištěno, že HLA-A je lokalizován v jádře (data nejsou uvedena), a vzhledem k tomu, že H2B a HMGA1 jsou také přítomny v jádře, tato interakce pravděpodobně nastává v jádře.Specifické adukty měřené mezi H2B, HLA-A a HMGA1 jsou znázorněny na obrázku 5D.
Většina interakcí HLA-A s jinými proteiny se vyskytuje v jeho α1 a α2 doménách a neuspořádané C-terminální doméně (obr. 6).V jednom z těchto příkladů jsme zjistili, že HLA-A interaguje s neuspořádaným N-terminálním koncem LRCH4 (obrázek 6A,D).LRCH4 reguluje aktivaci TLR4 a indukci cytokinů LPS, čímž moduluje vrozenou imunitní odpověď60,61.Je to membránový protein s devíti repeticemi bohatými na leucin (LRR) a homologním motivem kalmodulinu (CH) v jeho ektodoméně, následovaný transmembránovou doménou (TMD)60,62.Bylo popsáno, že CH domény zprostředkovávají interakce protein-protein60.Úsek asi 300 aminokyselin mezi doménami LRR a CH je relativně dostupný, ale neuspořádaný.Na základě funkce neuspořádaných oblastí jako mediátorů protein-proteinových sítí a vezikulárního transportu 63 jsme zjistili, že většina proteinových interakcí se vyskytuje v neuspořádaných oblastech.Interakce s MDN1 byly distribuovány po celé délce proteinu, včetně LRR1, LRR6, CH domén a náhodných oblastí, zatímco H2B se vázal hlavně na CH doménu (obr. 6A, B).Je pozoruhodné, že žádná z interakcí nezahrnovala TMJ, což naznačuje specifičnost přístupu CLMS (obrázek 6A, B).
MDN1 byl také identifikován jako součást proteinové sítě HLA-A (obrázek 6A).Patří do rodiny proteinů AAA (ATPázy spojené s různými aktivitami).Jedná se o stejnou N-terminální doménu AAA, která se organizuje do hexamerního kruhu a odstraňuje montážní faktor z ribozomální podjednotky 60S 64.se zdá být podobný dyneinu64,65,66.Kromě toho po oblasti bohaté na Asp/Glu následuje doména MIDAS (místo závislé na iontech kovu).Vzhledem k velké velikosti MDN1 (přibližně 5600 aminokyselin) a jeho omezené homologii s dobře prostudovanými proteiny je o jeho struktuře a funkci u lidí známo jen málo.Identifikovali jsme HLA-A, H2B a LRCH4 jako vazebné partnery MDN1 a odhalili jsme jejich orientaci jako proteinové komplexy v PyMol (obr. 6A,B).Tyto tři proteiny interagují s doménou AAA, doménou linkeru podobnou dyneinu a možná s doménou MIDAS MDN1.V předchozí zprávě afinitní čištění návnadových proteinů identifikovalo MDN1 jako protein spojený s histonem H2B67.Kromě toho nedávná studie také uvedla interakci mezi MDN a HLA-B v buňkách HCT116 pomocí afinitně purifikované hmotnostní spektrometrie, což podporuje naše zjištění68.Identifikace tohoto komplexu ve vzorcích ošetřených IFNa naznačuje roli MDN1 v interferonové signalizaci.
Protože HLA geny jsou vysoce polymorfní, extrahovali jsme sekvenační čtení mapující HLA-A, -B a -C z dat sekvenování RNA buněk Flo-1 (data nejsou uvedena).Peptidové sekvence konzistentní se sekvenačním čtením odhalily významné rozdíly mezi HLA-A, -B a -C v oblastech, kde byly v HLA-A umístěny zesíťované peptidy (obrázek S3).Navíc jsme nepozorovali zesíťování protein-to-protein molekul HLA-B/C s proteiny H2B/HMGA1/MDN1/LRCH4.To naznačuje, že proteinová interakce nalezená mezi HLA-A, MDN1, LRCH1 a HMGA1 je HLA-A specifická.Kromě toho proteomická analýza nezesítěných vzorků (tabulka S4) ukázala, že HLA-A má vyšší pokrytí sekvence ve srovnání s HLA-B nebo HLA-C.Peptidy identifikované pro HLA-A měly vysokou intenzitu jak ve vzorcích ošetřených IFNa, tak ve vzorcích bez ošetření.
Abychom zajistili, že zde identifikované interakce nebyly způsobeny nespecifickým zesítěním dvou proteinů v těsné prostorové blízkosti, dále jsme potvrdili dva nové HLA-A interagující faktory provedením koimunoprecipitačních testů.Interakce HLA-A s endogenními MDN1 a H2B byly detekovány v buňkách Flo-1 ošetřených IFNa i neošetřených (obrázek 7, obrázek S4).Potvrdili jsme, že HLA-A byl zachycen H2B v imunoprecipitátech a že tato asociace byla způsobena působením IFNa, protože HLA-A chyběla ve vzorcích imunoprecipitátu z neošetřených buněk (obrázek 7A).Naše data však naznačují, že IFNa odlišně reguluje vazbu HLA-A na H2B a MDN1.IFNα indukuje asociaci mezi H2B a HLA-A, ale snižuje její asociaci s MDN1.Zjistili jsme, že MDN1 byl spojen s HLA-A u kontrol a přidání IFNa snížilo tuto interakci nezávisle na indukci MDN1 pomocí IFNa (obrázek 7B,C).Kromě toho, HLA-A imunoprecipitace zachycené H2B v buňkách A549 (obr. S4), což naznačuje, že tato interakce je nezávislá na typu buňky.Celkově vzato tyto výsledky podporují interferonem zprostředkované interakce HLA-A s H2B a MDN1.
HLA-A společně čistí H2B a MDN1.Reprezentativní endogenní imunobloty H2B (A) a MDN1 (B) byly imunoprecipitovány z buněk Flo-1 ošetřených IFNa a sondovány na uvedené protilátky.Myší a králičí IgG byly použity jako negativní kontrola.(C) Relativní množství (vstup) různých antigenů jsou znázorněny imunobloty sondovanými proti uvedeným protilátkám, jako kontrola nanášení byl použit β-aktin.
Byly zkoumány strukturální vlastnosti jedné z interferonem indukovaných vysoce spolehlivých síťovaných sítí, H2B-HLA-A-HMGA1.Použili jsme modelování molekulární dynamiky jako alternativní přístup k pochopení konformační dynamiky proteinů zahrnutých v tomto komplexu (obrázek 8).Závěry z dat CLMS naznačují možnost různých konformací proteinů H2B, HLA-A a HMGA1.Proto byly v rozpouštědlovém médiu modelovány následující potenciální komplexy: H2B-HLA-A, HMGA1-HLA-A a H2B-HLA-A-HMGA1.Počáteční dokovací screening protein-protein za použití balíčku MOE (Molecular Operating Environment; Chemical Computing Group Inc., Montreal, Quebec, Kanada) navrhl možné konformace, které se mezi těmito proteiny liší (obr. 8A).Vizualizace dokovacího proteinového komplexu odhalila několik interakcí a možných konformací (obrázek 5A, 8).Jedna možná konformace je tedy znázorněna na obrázku 8A (s označenými příčnými vazbami) a byla dále vyhodnocena pomocí modelovacího potrubí MD.Navíc vazba H2B nebo HMGA1 na HLA-A zdůrazňuje vyšší afinitu H2B k HLA-A (obr. 8A).
Konformační dynamika možných sítí mezi komplexy H2B (H2BFS)-HLA-A, HMGA1-HLA-A a H2B-HLA-A-HMGA1.(A) Levý panel je 2D mapa (vygenerovaná v softwaru SIM-XL) intramolekulárních (červená) a intermolekulárních (modrá) příčných vazeb (mezní hodnota příčné vazby nastavena na 3,5).Kromě toho jsou identifikované zesíťující zbytky značeny na strukturách proteinů H2B, HLA-A a HMGA1.Přidružené konformace těchto proteinů byly extrahovány pomocí dokovacího potrubí implementovaného v balíčku MOE.Levý dolní panel ukazuje různé možné konformace komplexů H2B-HLA-A a HMGA1-HLA-A s různými vazebnými afinitami protein-protein (GBVI/WSA dG; kcal/mol).(B) Standardní odchylka (RMSD) atomových pozic (vyjma atomů vodíku) pro každou proteinovou strukturu.(C) Intermolekulární interakce protein-protein vodíkové vazby z různých simulovaných komplexů s ohledem na specifické interakce trvání ≥ 10 ns.Mezní vzdálenost donor-akceptor h-vazba byla nastavena na 3,5 Á a mezní úhel donor-H-akceptor byl nastaven na ≥ 160°–180°.(D) Značené zbytky tvořící interakce protein-protein HLA-A s jejich příslušnými partnery, o délce ≥ 20 ns, extrahované z fiktivních komplexů HLA-A-H2B a HLA-A-HMGA1.Proteinové struktury představují průměrnou strukturu 100 ns MDS.(E) Interakce mezi komplexy HLA-A-H2B a HLA-A-HMGA1 ve srovnání s interakcemi sledovanými simulací H2B-HLA po dobu 100 ns na základě místa interakce K nebo S mezi dvěma peptidy.Komplexy /HMGA1-HLA-A/H2B-HLA-A-HMGA1.Prahová hodnota pro hodnocení příčných vazeb byla nastavena na 3,0 a byly vzaty v úvahu specifické interakce z MDS s hodnotou ≥ 10 ns.Proteinové struktury byly vizualizovány pomocí balíčků BIOVIA Discovery Studio (Dassault Systèmes, BIOVIA Corp., San Diego, CA, USA) a Molecular Operating Environment (MOE; Chemical Computing Group Inc., Montreal, Quebec, Kanada).
Stabilita molekul HLA-A v čase (směrodatná odchylka; RMSD nebo standardní odchylka; RMSF) ukázala, že přítomnost proteinů H2B nebo HMGA1 v komplexech stabilizovala HLA-A (obrázek 8B, obrázek S5).Protein HMGA1 se pevně váže na místo B2M HLA-A, čímž indukuje stabilitu aminokyselin HLA-A v komplexu HLA-A-HMGA1 nebo H2B-HLA-A-HMGA1 (obrázek 8B, obrázek S5).zejména bylo zjištěno, že zbytky HLA -60-90 a -180-210 jsou méně flexibilní v přítomnosti H2B (obr. 8B).H2B a HMGA1 vykazovaly lepší vazbu na HLA-A v komplexu H2B-HLA-A-HMGA1 ve srovnání s vazbou HLA-A na H2B nebo HMGA1 samotnou (obrázek 8C, D; tabulka S5).Zbytky zapojené do vodíkových vazeb (MD modelovaná vysoká obsazenost ≥ 10 ns) se shodují s interakčními místy CLMS (zbytky K nebo S) v komplexu, což naznačuje, že interakce identifikované pomocí CLMS jsou velmi spolehlivé.Spolehlivost (obr. 8E).Při modelování CLMS a MD bylo zjištěno, že zbytky HLA-A mezi přibližně 190-210 a přibližně 200-220 aminokyselinami vážou H2B a HMGA1, v daném pořadí (OBR. 8E).
Interakce protein-protein tvoří dynamické strukturální sítě, které zprostředkovávají intracelulární komunikaci v reakci na určité podněty.Protože mnoho proteomických přístupů detekuje změny v celkové hladině ustáleného stavu proteinu, dynamika interakce protein-protein vyžaduje další nástroje pro zachycení vazebných rozhraní a CLMS je jedním z takových nástrojů.Interferonový signalizační systém je cytokinová síť, která umožňuje buňkám reagovat na řadu environmentálních patogenních a vnitřních patologických signálů, které kulminují indukcí podskupin interferonem indukovatelných proteinů.Použili jsme CLMS, abychom určili, zda lze mezi panelem proteinů indukovaných interferonem identifikovat nové interakce protein-protein.K zachycení proteinových komplexů byla použita globální analýza zesíťování proteinů v buněčném modelu Flo-1 citlivém na interferon.Extrakce tryptických peptidů z nezesítěných a zesíťovaných buněk umožňuje počítání peptidů, obohacení dráhy a distribuci délky peptidu s definovanou intenzitou LFQ.Kanonické proteiny indukovatelné interferonem byly identifikovány jako pozitivní vnitřní kontrola, zatímco byly pozorovány nové intermolekulární a intramolekulární zesíťované adukty kanonických proteinů indukovatelných interferonem, jako jsou MX1, UP18, OAS3 a STAT1.Byly zkoumány různé strukturální rysy a interakce ve funkčních oblastech.
Interakce mezi HLA-A, MDN1 a H2B byla detekována imunoblotem v buňkách Flo-1 a A549 ošetřených a neošetřených IFNa.Naše výsledky zdůrazňují, že HLA-A komplexuje s H2B způsobem závislým na IFNa.Naše práce představuje zajímavou cestu pro další zkoumání společné lokalizace těchto dvou komplexů.Bylo by také zajímavé rozšířit přístup CLMS na panel buněčných linií pro identifikaci interakcí proteinů zprostředkovaných interferonem nezávislých na buněčném typu.Nakonec jsme použili MD modelování jako alternativní přístup k pochopení konformační dynamiky proteinů zahrnutých v komplexu H2BFS-HLA-A-HMGA1, který sledoval intramolekulární a intermolekulární přeslechy.Závěry z dat CLMS naznačují možnost různých konformací proteinů H2BFS, HLA-A a HMGA1.Možné různé konformace mezi těmito dokovacími proteinovými komplexy odhalily několik interakcí podobných těm, které byly pozorovány v souboru dat CLMS.Jednou z hlavních předností naší metody je, že umožňuje snadnou identifikaci interagujících vysoce polymorfních genů, jako je HLA, takže bude zajímavé studovat interakce proteinů specifických pro HLA haplotyp, které je jinak obtížné studovat.Celkově naše data ukazují, že CLMS lze použít k rozšíření našeho chápání signálních sítí indukovaných interferonem a poskytnout základ pro studium složitějších mezibuněčných systémů v mikroprostředí nádoru.
Flo-1 buňky byly získány z ATCC a udržovány v DMEM (Gibco) doplněném 1% penicilinem/streptomycinem (Invitrogen), 10% fetálním bovinním sérem (Gibco) a skladovány při 37 °C a 5% C02.Inkubace.Buňky byly pěstovány do 70-80% konfluence, než byly ošetřeny IFNa14 (vyrábí Edinburgh Protein Production Facility).Všechny ostatní chemikálie a činidla byly zakoupeny od Sigma Aldrich, pokud není uvedeno jinak.
Flo-1 buňky byly kultivovány v 6-jamkových destičkách a další den byly buňky ošetřeny 10 ng/ml IFNa14 po dobu 24 hodin do přibližně 80% konfluence.Buňky byly třikrát promyty PBS a ligovány s čerstvě připraveným DSS (Thermo Fisher Scientific) (rozpuštěným v DMSO) v PBS po dobu 5 minut při 37 °C do konečné koncentrace 0,5 mM.DSS síťovací reakce byla nahrazena PBS a zbytkový DSS byl zastaven přidáním 20 mM Tris (pH 8,0) v PBS po dobu 15 minut při 37 °C.Buňky byly shromážděny seškrábáním a sebrány do zkumavek s nízkou vazbou (Axygen).
Buněčná peleta byla lyžována pomocí 300 ul močovinového lyzačního pufru (8 M močovina, 0,1 M Tris, pH 8,5) po dobu 30 minut při teplotě místnosti za občasného protřepávání.Všechny centrifugační kroky byly provedeny při 14 000 xg při 8 °C.Centrifugujte lyzát po dobu 10 minut a přeneste supernatant do nové zkumavky.Zbývající čiré částice byly rozpuštěny ve 150 ul druhého lyzačního pufru (2 M močovina, 2 % (w/v) SDS (dodecylsulfát sodný)) po dobu 30 minut nebo déle, dokud nebyl získán homogenní vodný roztok.Lyzát byl centrifugován po dobu 20 minut a supernatant byl smíchán s lyzátem získaným v předchozím kroku.Koncentrace proteinu byly hodnoceny pomocí testu Micro BCA (Thermo Fisher Scientific) podle pokynů výrobce pro postupy na mikrotitračních destičkách.Vzorky byly rychle zmraženy v kapalném dusíku a skladovány při -80 °C.
Přibližně 100 ug rozpustného zesíťovaného proteinu bylo zpracováno za použití modifikovaného protokolu pro přípravu filtračního vzorku (FASP), jak je popsáno v Wisniewski et al.69 Stručně, protein se zesíťuje s 200 ul močovinového pufru (8 M močovina v 0,1 M Tris, pH 8,5), vortexuje a rozpůlí.Všechny centrifugační kroky byly provedeny při 14 000 xg při 25 °C.První polovina zesíťovaného proteinového lyzátu byla přenesena do 10 kDa odstředivého filtračního zařízení Microcon vybaveného membránou Ultracel-10 (Merck), následovala centrifugace na filtru po dobu 25 minut.Poté přidejte druhou polovinu proteinu do filtru a opakujte stejné kroky.Izolace proteinu byla provedena přidáním 100 ul 17 mM tris(2-karboxyethyl)fosfin hydrochloridu (TCEP) v močovinovém pufru.Regenerace byla míchána v termomixéru při 600 otáčkách za minutu po dobu 30 minut při 37 °C.Kromě toho byla kolona odstředěna a redukovaný síťovaný protein byl alkylován za použití 100 ul 50 mM jodacetamidu v močovinovém pufru.Alkylační reakce byla prováděna při teplotě místnosti po dobu 20 minut ve tmě.Otočte kolonu, promyjte stěny kolony 3krát 100 µl močovinového pufru a poté odstřeďte.Stejná operace byla provedena 3krát s použitím 100 μl 100 mM hydrogenuhličitanu amonného.Před trypsinizací vyměňte odběrovou zkumavku za novou.Přidejte štěpící pufr obsahující 50 mM hydrogenuhličitanu amonného a 1 ul trypsinu zředěného v trypsinovém pufru (Promega).Poměr trypsinu k proteinu byl udržován na přibližně 1:33 a štěpící reakce byly inkubovány přes noc při 37 °C ve vlhké komoře.Zesítěný peptid byl eluován z filtru centrifugací po dobu 25 minut.Výtěžek peptidu byl zlepšen přidáním 50 μl 0,5 M NaCl do filtru a následnou centrifugací po dobu 25 minut.
Kolony C18 Micro Spin (Harvard Apparatus) byly použity k odsolení zesíťovaných tryptických peptidů podle protokolu popsaného Bouchalem et al.70 s malými modifikacemi.Stručně, C18 spinové kolony byly aktivovány třemi promytími 0,1% kyselinou mravenčí (FA) v acetonitrilu (AcN) (Merck) a dvěma promytími 0,1% FA.Kolona byla hydratována 0,1% FA po dobu 15 minut.Vzorky se nanesou do rotačních kolon a promyjí se 3krát 0,1% FA.Odsolené peptidy byly postupně eluovány stupňovitým gradientem za použití 50 %, 80 % a 100 % AcN v 0,1 % FA.Vzorky byly sušeny v koncentrátoru SpeedVac Plus (Eppendorf), dokud zbytková kapalina úplně nezmizela.Eluované peptidy byly rozpuštěny ve 100 ul 0,08% kyseliny trifluoroctové v 2,5% AcN a koncentrace byly měřeny na NanoDrop 2000 (Thermo Scientific).Přibližně 1 ug zesíťovaného peptidu na vzorek byl injikován do systému LC-MS/MS.
Zesíťované peptidy byly separovány na systému UltiMate 3000 RSLCnano LC (Thermo Scientific) připojeném k hmotnostnímu spektrometru Orbitrap Exploris 480 (Thermo Scientific).Zesíťované peptidy byly shromážděny na 300 um ID, 5 mm dlouhé u-předkolonové C18 záchytné koloně naplněné C18 PepMap100 sorbentem a 5 um PepMap sorbentem (Thermo Scientific).Naplňte průtokovou sadu pumpy rychlostí 5 ul/min 0,08% kyselinu trifluoroctovou rozpuštěnou v 2,5% AcN.Zesíťované peptidy byly separovány na analytické koloně z taveného oxidu křemičitého o vnitřním průměru 75 μm a délce 150 mm, naplněné 2 μm sorbentem PepMap (Thermo Scientific).Mobilní fáze A a B sestávaly z 0,1 % FA ve vodě a 0,1 % FA v acetonitrilu.Gradient začíná na 2,5 % B a lineárně se zvyšuje na 40 % B během 90 minut, poté na 90 % B během dalších 2 minut.Složení mobilní fáze bylo udržováno na 90 % B po dobu 10 minut a poté lineárně klesalo na 2,5 % B během 2 minut.Kolona byla ekvilibrována při 2,5 % B po dobu 8 minut před dalším cyklem.Zesíťované peptidy eluované z analytické kolony byly ionizovány ve zdroji nanoelektrosprejové ionizace (NSI) a injikovány do hmotnostního spektrometru Exploris 480 (Thermo Scientific).
Hmotnostní spektrometr Orbitrap Exploris 480 pracoval v režimu pozitivní korelace dat.Úplné skenování bylo provedeno v řezovém režimu při rozlišení 120 000 s nastavením rozsahu od m/z 350 Th do m/z 2000 Th.Normalizovaný cíl AGC byl nastaven na 300 % s maximální vstupní dobou 50 ms.Monoizotopová detekce píku byla zavedena pro peptidy.Parametr relaxace omezení je nastaven na hodnotu true, pokud je nalezeno příliš málo prekurzorů.Minimální iontová síla prekurzoru byla nastavena na 5,0e3 a do experimentů byly zahrnuty stavy nabití prekurzoru až +8.
Doba cyklu mezi hlavními skeny v režimu korelace dat byla nastavena na 2,5 sekundy.Dynamická hmotnostní exkluze byla nastavena na 20 s po první fragmentaci prekurzorového iontu.Okno pro izolaci prekurzoru bylo nastaveno na 2 Th.Typ normalizované srážkové energie s pevným režimem srážkové energie byl zvolen v datově závislém MS/MS skenu.Energie srážky nastavena na 30 %.Rozlišení Orbitrapu bylo nastaveno na 15 000 a cíl AGC na 100 %.Vlastní maximální doba vstřikování je nastavena na 60 milisekund.
Před sledováním sítě protein-protein v zesíťovaných vzorcích jsme zpracovali nezpracované soubory pomocí balíčku MaxQuant (verze 1.6.12.0)26,27 k identifikaci sledovatelných peptidů/proteinů ve vzorcích.Kromě toho byly podobné proteomické analýzy provedeny na nezesítěných vzorcích Flo-1 ošetřených a neošetřených IFNa.MS/MS data byla prohledávána v UniProt lidské databázi (www.uniprot.org) (nahráno 12. srpna 2020, obsahuje 75 093 záznamů) pomocí vestavěného vyhledávače Andromeda27.Hledání bylo provedeno bez uvedení specifičnosti enzymu a různých modifikací deamidace (N, Q) a oxidace (M).Tolerance hmotnosti prekurzoru byly nastaveny na 20 ppm a produktové ionty na 0,02 Da.Počáteční a maximální hmotnostní odchylka byla nastavena na 10 ppm.Maximální hmotnost peptidu byla nastavena na 4600 Da a sekvenční podobnost byla nastavena mezi 7 a 25 aminokyselinami (aa).Další statistická analýza byla provedena pomocí programu Perseus (verze 1.6.10.45).Obsah proteinu byl vypočten normalizací spektrální intenzity proteinu (intenzita LFQ; neznačená kvantifikace)27 a hodnoty intenzity byly převedeny na Log2.Hierarchické seskupení proteinů identifikovaných podle jejich peptidové intenzity bylo vytvořeno pomocí balíčku pheatmap (v1.0.12) v R (v 4.1.2).Analýza obohacení dráhy byla provedena pomocí databáze Reactome pathway pro proteiny ošetřené IFNa, které byly více než čtyřikrát aktivované ve srovnání s neošetřenými vzorky.
Identifikace lysinových (K) nebo serinových (S) specifických chemických křížových vazeb proteinových komplexů monitorovaných pomocí LC-MS/MS byla provedena pomocí spektroskopického identifikačního stroje (SIM-XL) pro zesíťované peptidy (SIM-XL)29.Nejprve byly zkoumány možné interakce mezi geny pro signaturu odolnosti proti poškození DNA (IRDS) související s interferonem (IFN) s použitím souboru dat proteinu IRDS popsaného v Padariya et al.28.Screening všech stavů a ​​opakování celého lidského UniProt je výpočetně náročný, takže celá databáze lidského UniProt (www.uniprot.org) (stažena 12. srpna 2020, obsahuje 75 093 záznamů) proti opakováním ošetřeným IFNα.Jeden z filtrů pro vysoce důvěryhodné interakce.Tyto získané vysoce významné interakce byly rozšířeny a testovány ve všech opakováních a podmínkách.
V SIM-XL byl DSS použit pro síťovací činidlo (XL) a posun hmotnosti XL a posun hmotnosti modifikace byly nastaveny na 138,06 a 156,07, v daném pořadí.Jsou uvažována následující síťovací reakční místa: KK, KS a KN-TERM, bez reportérových iontů.Prekurzor i fragment ppm byly nastaveny na 20 a práh Xrea byl nastaven na 0,15.Trypsin byl považován za zcela specifický a byla implementována metoda fragmentace vysokoenergetické C-pasti (HCD).Práh XCorr dynamické redukce DB a minimální počet peptidů pro dynamickou redukci DB byly nastaveny na 2,5 a 2, v daném pořadí.Další parametry jsou: pravděpodobnost monoizotopu a omezení koincidence píku, minimálně 4 zbytky AA na vlákno a maximální náboj vlákna a 3 maxima chybějících štěpení.Výsledné spojené 2D mapy byly analyzovány v (SIM-XL) a grafické znázornění xQuest28 bylo použito k vytvoření 2D map.Proteinové příčné vazby na proteinových strukturách jsou poskytovány v PyMol (PyMOL Molecular Graphics System, verze 2.0 Schrödinger, LLC).
Struktury proteinových modelů byly vytvořeny pomocí serveru Phyre2 (http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/phyre2)11 s využitím principů homologního modelování a implementace „Skryté Markovovy metody“.Phyre2 generuje modelové struktury založené na sekvenčním zarovnání se známými proteinovými strukturami.Pro proteiny H2BFS, HLA-A, HMGA1, LRCH4 a MDN1 byly použity templátové struktury 1kx552, 1kj349, 2eze55, 6hlu62 a 6i2665.Kromě toho byla zvažována také struktura AlphaFold71 MX1, UBP18 a ROBO1.Proteinová struktura byla vizualizována pomocí balíčku BIOVIA Discovery Studio Visualizer (Dassault Systèmes, BIOVIA, San Diego, CA, USA) a balíčku Molecular Operating Environment (MOE; Chemical Computing Group Inc., Montreal, Quebec, Kanada).