347 12,7*1,24mm spirálová trubka z nerezové oceli,Molekulární mechanismus synchronní elektrostatické kondenzace a koagregace α-synukleinu a tau

Děkujeme, že jste navštívili Nature.com.Používáte verzi prohlížeče s omezenou podporou CSS.Chcete-li dosáhnout nejlepšího výsledku, doporučujeme použít aktualizovaný prohlížeč (nebo vypnout režim kompatibility v aplikaci Internet Explorer).Abychom zajistili trvalou podporu, zobrazujeme web bez stylů a JavaScriptu.
Posuvníky zobrazující tři články na snímku.Pro pohyb mezi snímky použijte tlačítka zpět a další, pro pohyb po jednotlivých snímcích použijte tlačítka posuvného ovladače na konci.

Specifikace trubek z nerezové oceli 347

347 12,7*1,24mm Nerezová spirálová trubka

Vnější průměr: 6,00 mm vnější průměr až 914,4 mm vnější průměr, velikosti do 24” NB dostupné ze skladu, vnější průměr Ocelové trubky dostupné ze skladu

SS 347 Rozsah tloušťky trubky: 0,3 mm – 50 mm, SCH 5, SCH10, SCH 40, SCH 80, SCH 80S, SCH 160, SCH XXS, SCH XS
WT: SCH5S, SCH10S, SCH40S, SCH80S, SCH160S atd. (0,5-12 mm) Nebo nepravidelná velikost, která bude přizpůsobena podle potřeby

Typ: Bezešvé trubky SS 347 |Trubky SS 347 ERW |SS 347 Svařované trubky |Trubky SS 347 |Trubky SS 347 CDW, trubky LSAW / švem svařované / překreslené

Tvar: SS 347 kulaté trubky/ trubky, SS 347 čtvercové trubky/ trubky, SS 347 obdélníkové trubky/ trubky, SS 347 spirálové trubky, SS 347 „U“ tvar, SS 347 Pan Cake Coils, SS 347 hydraulické trubky

Délka: jednoduchý náhodný, dvojitý náhodný a konec s požadovanou délkou: hladký konec, zkosený konec, se vzorkem

Koncová ochrana: Plastové krytky |Vnější povrchová úprava: 2B, č. 4, č. 1, č. 8 Zrcadlová povrchová úprava pro trubky z nerezové oceli, povrchová úprava podle požadavků zákazníka

Stav dodávky: žíhané a mořené, leštěné, leskle žíhané, tažené za studena

Inspekce, protokoly o zkouškách: Certifikáty mlýnských testů, EN 10204 3.1, chemické protokoly, mechanické protokoly, protokoly PMI o zkouškách, vizuální kontrolní protokoly, kontrolní protokoly třetích stran, laboratorní protokoly schválené NABL, protokoly o destruktivních zkouškách, protokoly o nedestruktivních testech

Balení: Baleno v dřevěných krabicích, plastových sáčcích, ocelových pásech v balíčku nebo podle požadavků zákazníků

Speciality: Velikosti a specifikace jiné než výše uvedené mohou být vyrobeny na vyžádání

Rozsah velikostí potrubí SS 347: 1/2 palce NB, vnější průměr až 24 palců

ASTM A312 347: Bezešvá austenitická trubka s rovným švem určená pro vysokoteplotní a obecně korozivní provoz.Přídavný kov není při svařování povolen.

ASTM A358 347: Elektricky tavně svařované austenitické trubky pro korozivní a/nebo vysokoteplotní provoz.Podle této specifikace se obvykle vyrábí pouze potrubí do 8 palců.Při svařování je povoleno přidávání přídavného kovu.

ASTM A790 347: Bezešvé a s rovným švem svařované feriticko/austenitické (duplexní) potrubí určené pro obecný korozní provoz, se zvláštním důrazem na odolnost vůči praskání korozí pod napětím.

ASTM A409 347: Elektricky tavně svařovaná austenitická světlostěnná trubka s přímým nebo spirálovým švem o velkém průměru ve velikostech 14” až 30” se stěnami Sch5S a Sch 10S pro korozivní a/nebo vysoké

ASTM A376 347: Bezešvé austenitické potrubí pro vysokoteplotní aplikace.

ASTM A813 347: Jednosvarové, jednoduše nebo dvojitě svařované austenitické trubky pro vysokoteplotní a obecné korozní aplikace.

ASTM A814 347: Za studena svařovaná austenitická trubka pro vysokoteplotní a obecně korozivní provoz.

Chemické složení trubek z nerezové oceli 347H

Mechanické vlastnosti trubky z nerezové oceli 347H

Trubky z nerezové oceli 347H Fyzikální vlastnosti

Ekvivalentní třídy pro trubky z nerezové oceli 347H

Agregace amyloidu alfa-synukleinu (αS) je charakteristickým znakem Parkinsonovy choroby a dalších synukleinopatií.Nedávno byl protein tau běžně spojovaný s Alzheimerovou chorobou spojen s patologií aS a bylo zjištěno, že se ko-lokalizuje v inkluzích bohatých na aS, ačkoli molekulární mechanismus koagregace těchto dvou proteinů zůstává nejasný.Uvádíme zde, že aS fáze se odděluje na kapalné kondenzáty prostřednictvím elektrostatické komplexní kondenzace s kladně nabitými polypeptidy, jako je tau.V závislosti na afinitě αS k polykationtům a rychlosti valenčního vyčerpání koagulační sítě procházejí sraženiny rychlou gelací nebo koalescencí následovanou pomalou agregací amyloidu.Kombinací sady pokročilých biofyzikálních technik jsme byli schopni charakterizovat separaci fáze kapalina-kapalina αS/Tau a identifikovat klíčové faktory, které vedou k tvorbě heterogenních agregátů obsahujících oba proteiny v kapalném proteinovém kondenzátu.
Kromě membránových kompartmentů lze prostorové separace v buňkách dosáhnout také tvorbou na proteiny bohatých, kapalině podobných hustých tělísek nazývaných biomolekulární kondenzáty nebo kapičky, prostřednictvím procesu známého jako separace kapaliny a kapaliny (LLPS).Tyto kapičky jsou tvořeny multivalentními dočasnými interakcemi, obvykle mezi proteiny nebo proteiny a RNA, a slouží různým funkcím téměř ve všech živých systémech.Velký počet proteinů schopných LLP vykazuje sekvence s nízkou komplexitou, které jsou vysoce neuspořádané v přírodě a při tvorbě biomolekulárních kondenzátů3,4,5.Četné experimentální studie odhalily flexibilní, často neuspořádanou a multivalentní povahu proteinů, které tvoří tyto kapalné kondenzáty, i když je málo známo o specifických molekulárních determinantech, které řídí růst a zrání těchto kondenzátů na pevné látky. Stát..
Nová data podporují hypotézu, že aberantní proteinem řízený LLPS a transformace kapiček do pevných struktur mohou být relevantními buněčnými cestami vedoucími k tvorbě nerozpustných toxických agregátů, které jsou často charakteristickým znakem degenerativních onemocnění.Mnoho LLPS-asociovaných vnitřně neuspořádaných proteinů (IDP), často vysoce nabitých a flexibilních, bylo dlouho spojeno s neurodegenerací prostřednictvím procesu amyloidové agregace.Zejména bylo prokázáno, že biomolekulární kondenzáty IDP, jako je FUS7 nebo TDP-438 nebo proteiny s velkými doménami s nízkou složitostí, jako je hnRNPA19, stárnou do gelových nebo dokonce pevných forem prostřednictvím procesu zvaného fluidizace.sloučenina.na přechod na pevnou fázi (LSPT) jako funkci času nebo jako odpověď na určité posttranslační modifikace nebo patologicky významné mutace1,7.
Další IDP asociovaný s LLPS in vivo je Tau, neuspořádaný protein spojený s mikrotubuly, jehož amyloidní agregace se podílí na Alzheimerově chorobě10, ale nedávno se také podílela na Parkinsonově chorobě (PD) a další synaptické nukleární proteinopatie 11, 12, 13 spolu souvisí.Ukázalo se, že Tau spontánně disociuje z roztoku/cytoplazmy v důsledku příznivých elektrostatických interakcí14, což vede k tvorbě kapiček obohacených o tau, známých jako elektrostatické koacerváty.Bylo také pozorováno, že tento typ nespecifické interakce je hnací silou mnoha biomolekulárních kondenzátů v přírodě15.V případě proteinu tau může být elektrostatická agregace tvořena jednoduchou agregací, při které opačně nabité oblasti proteinu spouštějí proces štěpení, nebo komplexní agregací prostřednictvím interakce s negativně nabitými polymery, jako je RNA.
Nedávno byl na buněčných a zvířecích modelech prokázán α-synuklein (αS), amyloid IDP, který se podílí na PD a dalších neurodegenerativních onemocněních souhrnně známých jako synukleinopatie17,18, koncentrovaný v proteinových kondenzátech s chováním podobným tekutině.Studie in vitro ukázaly, že αS podléhá LLPS jednoduchou agregací prostřednictvím převážně hydrofobních interakcí, ačkoli tento proces vyžaduje výjimečně vysoké koncentrace proteinů a atypicky dlouhé inkubační doby19,21.Klíčovým nevyřešeným problémem zůstává, zda jsou kondenzáty obsahující aS pozorované in vivo tvořeny tímto nebo jinými procesy LLPS.Podobně, ačkoli agregace amyloidů byla pozorována v neuronech u PD a jiných synukleinopatií, přesný mechanismus, kterým aS podléhá intracelulární agregaci amyloidu, zůstává nejasný, protože se nezdá, že by nadměrná exprese tohoto proteinu sama o sobě spouštěla ​​tento proces.Často je vyžadováno další buněčné poškození, což naznačuje, že určitá buněčná umístění nebo mikroprostředí jsou nutná pro renukleaci intracelulárních aS amyloidních sestav.Jedno buněčné prostředí, které je zvláště náchylné k agregaci, může být vnitřek proteinových kondenzátů23.
Zajímavé je, že bylo zjištěno, že αS a tau se společně lokalizují v charakteristických chorobných inkluzích u lidí s Parkinsonovou chorobou a jinými synukleinopatiemi 24,25 a experimenty uvádějí synergický patologický vztah mezi těmito dvěma proteiny 26,27, což naznačuje potenciální vztah mezi agregací αS a tau u neurodegenerativních onemocnění.nemoc.Bylo zjištěno, že aS a tau interagují a podporují vzájemnou agregaci in vitro a in vivo28,29 a v mozcích pacientů se synukleinopatiemi byly pozorovány heterogenní agregáty složené z těchto dvou proteinů30.O molekulárním základu interakce mezi αS a tau a mechanismu jejich společné agregace je však známo jen málo.Bylo popsáno, že aS interaguje s tau prostřednictvím elektrostatické přitažlivosti mezi vysoce záporně nabitou C-koncovou oblastí aS a centrální oblastí tau bohatou na prolin, která je také obohacena o kladně nabité zbytky.
V této studii jsme ukázali, že αS se může skutečně disociovat na kapičky prostřednictvím elektrostatické komplexní kondenzace v přítomnosti proteinu tau, na rozdíl od jeho interakce s jinými kladně nabitými polypeptidy, jako je poly-L-lysin (pLK), a v tomto procesu .αS působí jako molekula lešení pro síť kapiček.Identifikovali jsme znatelné rozdíly v procesu zrání elektrostatických αS koacervátů, které jsou spojeny s rozdíly ve valenci a síle interakce proteinů zapojených do koacervátové sítě.Je zajímavé, že jsme pozorovali společnou agregaci aS a tau amyloidních proteinů v kapalných koacervátech s dlouhou životností a identifikovali jsme některé klíčové faktory, které vedou ke společné agregaci těchto dvou proteinů v takových koacervátech.Zde podrobně popisujeme tento proces, který je možným molekulárním mechanismem, který je základem kolokalizace dvou proteinů v inkluzích specifických pro onemocnění.
αS má vysoce aniontový C-koncový konec při neutrálním pH (obr. 1a) a předpokládali jsme, že by mohl podstoupit LLPS prostřednictvím kondenzace elektrostatických komplexů s polykationtovými neuspořádanými polypeptidovými molekulami.Jako výchozí modelovou molekulu jsme použili 100zbytkový poly-L-lysin (pLK) díky jeho kladně nabité a neuspořádané polymerní povaze při neutrálním pH 32. Nejprve jsme potvrdili, že pLK interaguje s Ct doménou αS pomocí NMR spektroskopie v roztoku (Obrázek 1b) s použitím 13C/15N-značeného aS v přítomnosti zvyšujících se molárních poměrů aS:pLK.Interakce pLK s Ct doménou αS se projevuje perturbacemi chemického posunu a snížením maximální intenzity v této oblasti proteinu.Je zajímavé, že když jsme smíchali αS s pLK v koncentraci αS cca.5–25 µM v přítomnosti polyethylenglykolu (5–15 % PEG-8) (typický LLPS pufr: 10 mM HEPES pH 7,4, 100 mM NaCl, 15 % PEG-8) jsme okamžitě prošli širokým polem tvorby proteinů .kapičky byly pozorovány pomocí fluorescenční (WF) a mikroskopie ve světlém poli (BF) (obr. 1c).1-5 µm kapičky obsahující koncentrovaný αS (přidaný 1 µM AlexaFluor488-značený αS, AF488-αS), jejich elektrostatické vlastnosti lze odvodit z jejich odolnosti vůči 10 % 1,6-hexandiolu (1,6-HD) a jeho citlivosti na zvýšení koncentrace NaCl (obr. 1c).Tekutá povaha koacervátů elektrostatického komplexu αS/pLK je demonstrována jejich schopností fúzovat během milisekund (obr. 1d).Pomocí turbidimetrie jsme kvantifikovali tvorbu kapiček za těchto podmínek, potvrdili elektrostatickou povahu hlavní interakce spojené s její stabilitou (obr. 1e) a vyhodnotili vliv různých poměrů polymerů na proces LLPS (obr. 1f).Ačkoli je tvorba kapiček pozorována v širokém rozmezí poměrů polymerů, proces je velmi příznivý, když je pLK v přebytku aS.LLP byly také pozorovány za použití chemicky odlišného vytěsňovacího činidla dextran-70 (70 kDa) nebo s použitím různých formátů vzorků, včetně kapek na skleněném podložním sklíčku, mikrotitračních jamek z různých materiálů, Eppendorfových nebo křemenných kapilár.
a Schematické znázornění různých proteinových oblastí ve variantách WT-αS a ACt-αS použitých v této studii.Amfipatická N-terminální doména, hydrofobní oblast tvořící amyloid (NAC) a záporně nabitá C-terminální doména jsou znázorněny modře, oranžově a červeně.Je zobrazena mapa čistého poplatku za reziduální (NCPR) WT-αS.b NMR analýza interakce aS/pLK v nepřítomnosti makromolekulárních shluků.Jak se koncentrace pLK zvyšuje (molární poměry aS:pLK 1:0,5, 1:1,5 a 1:10 jsou znázorněny světle zelenou, zelenou a tmavě zelenou barvou).c Koacervujte αS/pLK (molární poměr 1:10) při 25 µM (1 µM AF488-značený aS nebo Atto647N-značený pLK pro WF zobrazování) v LLPS pufru (nahoře) nebo doplněném 500 mM NaCl (vlevo dole) nebo po 10 % 1,6-hexandiolu (1,6-HD; vpravo dole).Měřítko = 20 um.d Reprezentativní mikroskopické snímky BF kapkové fúze αS/pLK (molární poměr 1:10) při koncentraci 25 μM;šipky označují sloučení jednotlivých kapek (červené a žluté šipky) do nové kapky (oranžová šipka) během 200 ms) .Měřítko = 20 um.e Rozptyl světla (při 350 nm) aS/pLK agregace v LLPS pufru před a po přidání 500 mM NaCl nebo 10% 1,6-HD při 25 uM αS (N = 3 replikáty vzorku, průměr a standardní odchylka je také uvedena).f BF obraz (nahoře) a analýza rozptylu světla (při 350 nm, dole) agregace αS/pLK při 25 μM αS se zvyšujícím se molárním poměrem αS:pLK (N = 3 replikáty vzorku, je také uvedena střední a standardní odchylka).Měřítko = 10 um.Měřítko na jednom obrázku označuje měřítko všech obrázků v jednom panelu.Nezpracovaná data jsou poskytována ve formě souborů nezpracovaných dat.
Na základě našich pozorování kondenzace elektrostatického komplexu αS/pLK a předchozích pozorování αS jako klientské molekuly kondenzátu tau/RNA prostřednictvím přímé interakce s tau31 jsme předpokládali, že αS a tau by mohly společně segregovat s rozpouštědlem v nepřítomnosti RNA kondenzace.prostřednictvím elektrostatických komplexů a aS je skeletový protein v koacervátech aS/Tau (viz rozložení náboje tau na obrázku 2e).Pozorovali jsme, že když se 10 μM αS a 10 μM Tau441 (obsahující 1 μM AF488-αS a 1 μM Atto647N-Tau, v daném pořadí) smíchaly dohromady v pufru LLPS, snadno vytvořily proteinové agregáty obsahující oba proteiny, jak je vidět z mikroskopie WF.(obr. 2a).Kolokalizace dvou proteinů v kapičkách byla potvrzena konfokální (CF) mikroskopií (doplňkový obr. 1a).Podobné chování bylo pozorováno, když byl jako agregační činidlo použit dextran-70 (doplňkový obr. 1c).S použitím buď FITC-značeného PEG nebo dextranu jsme zjistili, že obě vytěsňovací činidla byla rovnoměrně distribuována ve vzorcích, nevykazovala ani segregaci ani asociaci (doplňkový obr. 1d).Spíše to naznačuje, že v tomto systému podporují separaci fází prostřednictvím makromolekulárních vytěsňovacích efektů, protože PEG je přednostně stabilní vytěsňovací činidlo, jak je vidět v jiných systémech LLP33,34.Tyto kapičky bohaté na proteiny byly citlivé na NaCl (1 M), ale ne na 1,6-HD (10% v/v), což potvrzuje jejich elektrostatické vlastnosti (doplňkový obrázek 2a, b).Jejich tekuté chování bylo potvrzeno pozorováním milisekundových slučovacích kapiček pomocí BF mikroskopie (obr. 2b).
a Snímky konfokální (CF) mikroskopie koacervátů aS/Tau441 v pufru LLPS (10 uM každého proteinu, 0,5 uM aS značeného AF488 a Tau441 značeného Atto647N).b Reprezentativní snímky diferenciálního interferenčního kontrastu (DIC) událostí kapkové fúze αS/Tau441 (10 μM pro každý protein).c Fázový diagram založený na rozptylu světla (při 350 nm) Tau441 LLPS (0–15 µM) v nepřítomnosti (vlevo) nebo přítomnosti (vpravo) 50 µM αS.Teplejší barvy znamenají větší rozptyl.d Rozptyl světla vzorků αS/Tau441 LLPS se zvyšující se koncentrací αS (Tau441 při 5 µM, N = 2–3 opakování vzorku, jak je uvedeno).e Schematické znázornění některých variant tau proteinu a různých oblastí proteinu použitých v této studii: negativně nabitá N-terminální doména (červená), oblast bohatá na prolin (modrá), doména vázající mikrotubuly (MTBD, zvýrazněno oranžově) a párová spirála tvořící amyloid.oblasti filamentu (PHF) umístěné v MTBD (šedá).Je zobrazena mapa čistého poplatku za zbytek (NCPR) Tau441.f Použití 1 uM αS značeného AF488 a ΔNt- značeného Atto647N, použití 1 μM αS nebo ACT-αS značeného AF488 v přítomnosti ANt-Tau (nahoře, 10 μM na protein) nebo K18 (dole, dole ) ) ) mikrofotografie WF kondenzované v LLPS nebo K18 pufru.Úsečky měřítka na jednom obrázku představují měřítko všech obrázků na jednom panelu (20 µm pro panely a, b a f).Nezpracovaná data pro panely c a d jsou poskytovány jako soubory nezpracovaných dat.
Abychom otestovali roli αS v tomto procesu LLPS, nejprve jsme zkoumali účinek αS na stabilitu kapek pomocí nefelometrie s použitím zvyšujících se koncentrací NaCl (obr. 2c).Čím vyšší je koncentrace soli ve vzorcích obsahujících αS, tím vyšší jsou hodnoty rozptylu světla (při 350 nm), což ukazuje na stabilizační roli αS v tomto systému LLPS.Podobný účinek lze pozorovat zvýšením koncentrace αS (a tedy poměru αS:Tau441) na cca.10násobné zvýšení vzhledem ke koncentraci tau (5 uM) (obr. 2d).Abychom demonstrovali, že αS je skeletový protein v koacervátech, rozhodli jsme se prozkoumat chování mutantu Tau s narušeným LLPS, který postrádá negativně nabitou N-terminální oblast (zbytky 1–150, viz obr. 2e) nazývanou ΔNt-Tau.WF mikroskopie a nefelometrie potvrdily, že samotný ΔNt-Tau nepodstoupil LLPS (obr. 2f a doplňkový obr. 2d), jak již bylo uvedeno 14. Když se však do disperzních roztoků této zkrácené varianty Tau přidal αS, proces LLPS byl zcela obnovena s hustotou kapek blízkou hustotě kapiček roztoků Tau a αS plné velikosti za podobných podmínek a koncentrací proteinů.Tento proces lze také pozorovat za podmínek nízkého makromolekulárního shlukování (doplňkový obr. 2c).Role C-terminální αS oblasti, ale ne celé její délky, v procesu LLPS byla prokázána inhibicí tvorby kapiček pomocí C-terminální zkrácené αS varianty postrádající zbytky 104–140 (obr. 1a) z (ΔCt- aS) protein (obr. 2f a doplňkový obr. 2d).Kolokalizace αS a ΔNt-Tau byla potvrzena konfokální fluorescenční mikroskopií (doplňkový obr. 1b).
K dalšímu testování mechanismu LLPS mezi Tau441 a αS byla použita další varianta Tau, konkrétně fragment párového helikálního vlákna (PHF) v doméně vázající mikrotubuly (MTBD), který pokud obsahuje čtyři charakteristické repetitivní domény, běžně také známé jako fragment K18 (viz obr. 2e).Nedávno bylo publikováno, že aS se přednostně váže na protein tau umístěný v doméně bohaté na prolin v sekvenci, která předchází doménu vázající mikrotubuly.Oblast PHF je však také bohatá na pozitivně nabité zbytky (viz obrázek 2e), zejména lysin (15 % zbytků), což nás přimělo otestovat, zda tato oblast také přispívá ke kondenzaci komplexu aS/Tau.Pozorovali jsme, že samotný K18 nemohl spustit LLPS v koncentracích až 100 uM za testovaných podmínek (pufr LLPS s 15 % PEG nebo 20 % dextranu) (obrázek 2f).Když jsme však přidali 50 uM aS k 50 uM K18, rychlá tvorba proteinových kapiček obsahujících K18 a aS byla pozorována nefelometrií (doplňkový obr. 2d) a WF mikroskopií (obr. 2f).Jak se očekávalo, ACt-αS nebyl schopen obnovit LLPS chování K18 (obr. 2f).Všimli jsme si, že agregace αS/K18 vyžaduje mírně vyšší koncentrace proteinu k indukci LLPS ve srovnání s αS/ANt-Tau nebo αS/Tau441, ostatní věci jsou stejné.To je v souladu se silnější interakcí aS C-koncové oblasti s doménou Tau bohatou na prolin ve srovnání s doménou vázající mikrotubuly, jak bylo popsáno dříve31.
Vzhledem k tomu, že ΔNt-Tau nemůže provádět LLPS v nepřítomnosti αS, vybrali jsme tuto variantu Tau jako model pro charakterizaci αS/Tau LLPS vzhledem k její jednoduchosti v systémech LLPS s Tau v plné délce (izotyp, Tau441/Tau441).se složitými (heterotypickými, αS/Tau441) agregačními procesy.Porovnali jsme stupeň agregace αS (jako součást proteinu kondenzované fáze, fαS,c) v systémech αS/Tau a αS/ΔNt-Tau centrifugací a analýzou SDS-PAGE v disperzní fázi (viz 2e), našli jsme velmi podobné hodnoty pro všechny proteiny ve stejné koncentraci.Konkrétně jsme získali fαS,c 84 ± 2 % a 79 ± 7 % pro aS/Tau a αS/ANt-Tau, v daném pořadí, což naznačuje, že heterotypická interakce mezi aS a tau je lepší než interakce mezi molekulami tau.mezi.
Interakce s různými polykationty a vliv kondenzačního procesu na kinetiku αS byly nejprve studovány metodou obnovy fluorescence po fotobělení (FRAP).Testovali jsme koacerváty αS/Tau441, αS/ANt-Tau a αS/pLK (100 μM αS doplněné 2 μM αS AF488-αS a 100 μM Tau441 nebo ANt-Tau nebo 1 mM pLK).Data byla získána během prvních 30 minut po smíchání složek vzorku.Z reprezentativních snímků FRAP (obr. 3a, kondenzace αS/Tau441) a jejich odpovídajících křivek časového průběhu (obr. 3b, doplňkový obr. 3) lze vidět, že kinetika αS je velmi podobná kinetice koacervátů Tau441.a ΔNt-Tau, který je mnohem rychlejší s pLK.Vypočtené difúzní koeficienty pro aS uvnitř koacervátu podle FRAP (jak je popsáno Kangem et al. 35) jsou D = 0,013 ± 0,009 µm2/sa D = 0,026 ± 0,008 µm2/s pro αS/Tau441 a αNt-aS/s systém αS/.pLK, Tau a D = 0,18 ± 0,04 um2/s, v daném pořadí (obr. 3c).Difúzní koeficient αS v dispergované fázi je však o několik řádů vyšší než u všech kondenzovaných fází, jak je stanoveno fluorescenční korelační spektroskopií (FCS, viz doplňkový obr. 3) za stejných podmínek (LLPS pufr), ale bez polykationtů (D = 8 ± 4 um2/s).Kinetika αS translace je proto u koacervátů výrazně snížena ve srovnání s proteiny v dispergované fázi v důsledku výrazných efektů shlukování molekul, ačkoli všechny koacerváty si zachovávají vlastnosti kapaliny během první půl hodiny po jejich vytvoření, na rozdíl od fáze tau.rychlejší kinetika v kondenzátu pLK.
a–c FRAP analýza dynamiky αS (2 % αS značená AF488) v elektrostatických koacervátech.Reprezentativní obrázky testů aS/Tau441 FRAP v triplikátech jsou ukázány v (a), kde červené kroužky označují odbarvené oblasti.Měřítko je 5 µm.b Průměrné křivky FRAP a (c) vypočtené difúzní koeficienty (D) pro 5–6 (N) různých kapiček ze tří experimentů s použitím 100 µM αS a ekvimolárních koncentrací Tau441 (červená) nebo ΔNt-Tau (modrá) nebo pLK (zelená) při desetinásobku koncentrace LLPS.Směrodatná odchylka křivky FRAP je zobrazena stínovanou barvou.Pro srovnání byl difúzní koeficient aS v dispergované fázi stanoven trojmo pomocí fluorescenční korelační spektroskopie (FCS) (další informace viz doplňkový obrázek 3 a metody).d Kontinuální X-pásmová EPR spektra 100 μM TEMPOL-122-αS v pufru LLPS bez jakéhokoli polykationtu (černá) nebo v přítomnosti 100 μM Tau441 (červená) nebo ΔNt-Tau (modrá) nebo 1 mM pLK (zelená).Vložka ukazuje zvětšený pohled na silné siločáry, kde dochází k nejdramatičtějším změnám.e Vazebné křivky 50 μM TEMPOL-122-αS s různými polykationty v nepřítomnosti LLPS (bez PEG).Ukázalo se, že snížená amplituda pásu III ve srovnání s pásem II (IIII/III) normalizovaného spektra EPR zvyšuje molární poměry Tau441 (červená), ANt-Tau (modrá) a pLK (zelená).Barevné čáry znázorňují přizpůsobení datům s použitím modelu hrubé vazby s n identickými a nezávislými vazebnými místy na každé křivce.Nezpracovaná data jsou poskytována ve formě souborů nezpracovaných dat.
Jako doplněk jsme zkoumali dynamiku αS v různých koacervátech pomocí směrovaného spinového značení (SDSL) a kontinuální elektronové paramagnetické rezonance (CW-EPR).Tato metoda se ukázala jako velmi užitečná při vykazování flexibility a dynamiky IDP s realistickým zbytkovým rozlišením36,37,38.Za tímto účelem jsme zkonstruovali cysteinové zbytky v jednotlivých mutantech Cys a použili jsme spinovou sondu 4-hydroxy-2,2,6,6-tetramethylpiperidin-N-oxyl (TEMPOL).Deriváty maleimidu je označují.Přesněji jsme vložili sondy TEMPOL na pozici 122 nebo 24 aS (TEMPOL-122-aS a TEMPOL-24-aS).V prvním případě cílíme na C-terminální oblast proteinu, která se účastní interakce s polykationty.Místo toho nám pozice 24 může poskytnout informace o celkové dynamice proteinů v kondenzátu.V obou případech EPR signály získané pro proteiny dispergované fáze odpovídaly nitroxidovým radikálům v rychle se pohybujícím stavu.Po separaci fází v přítomnosti tau nebo pLK (100 μM TEMPOL-αS, Tau441 nebo ΔNt-Tau v poměru 1:1 nebo pLK v poměru 1:10) bylo pozorováno zvýšení relativní intenzity píku v EPR spektrum αS.Ztrátová čára se rozšířila, což ukazuje na sníženou kinetiku αS reorientace v kapičkách ve srovnání s proteinem ve zředěné fázi (obr. 3d, doplňkový obr. 4a).Tyto změny jsou výraznější v poloze 122. Zatímco v poloze 24 přítomnost pLK neovlivnila kinetiku sondy, v poloze 122 se tvar spektrální čáry výrazně změnil (doplňkový obr. 4a).Když jsme se pokusili modelovat spektra na pozici 122 dvou systémů αS/polykation pomocí izotropního modelu (doplňkový obrázek 5a), který se běžně používá k popisu dynamiky spinově značeného IDP38,39, nebyli jsme schopni rekonstruovat experimentální spektra..Spektrální simulace polohy kontrastů 24 spinů (doplňkový obr. 5a).To naznačuje, že existují preferenční pozice v prostoru spinových konfigurací C-terminální oblasti aS v přítomnosti polykationtů.Při zvažování frakce αS v kondenzované fázi za experimentálních podmínek EPR (84 ± 2 %, 79 ± 7 % a 47 ± 4 % pro αS/Tau441, αS/ΔNt-Tau a αS/pLK, v tomto pořadí – viz doplňkové Obr. 2e analýzy dat c), je vidět, že rozšíření detekované metodou EPR odráží především interakci C-terminální oblasti αS s různými polykationty v kondenzované fázi (hlavní změna při použití TEMPOL-122- αS), a ne kondenzaci proteinů.V sondě je pozorováno zvýšení mikroviskozity.Jak se očekávalo, EPR spektrum proteinu za jiných podmínek než LLPS bylo zcela obnoveno, když byl do směsi přidán 1 M NaCl (doplňkový obrázek 4b).Celkově naše data naznačují, že změny detekované pomocí CW-EPR odrážejí hlavně interakci C-terminální oblasti aS s různými polykationty v kondenzované fázi a tato interakce se zdá být silnější s pLK než s Tau.
Abychom získali více strukturních informací o proteinech v koacervátu, rozhodli jsme se studovat systém LLPS pomocí NMR v roztoku.Mohli jsme však detekovat pouze frakci αS zbývající v dispergované fázi, což může být způsobeno sníženou dynamikou proteinu uvnitř koacervátu a hustou fází na dně roztoku v NMR analýze.Když jsme analyzovali strukturu a dynamiku proteinu zbývajícího v dispergované fázi vzorku LLPS pomocí NMR (doplňkový obr. 5c, d), všimli jsme si, že protein se choval téměř identicky v přítomnosti pLK a ANt-Tau, obou které byly v sekundární struktuře a dynamice proteinové páteře, odhalené experimenty na sekundárním chemickém posunu a relaxaci R1ρ.NMR data ukazují, že C-konec aS trpí významnou ztrátou konformační flexibility, přičemž si zachovává svou neuspořádanou povahu, stejně jako zbytek proteinové sekvence, v důsledku jeho interakcí s polykationty.
Protože rozšíření signálu CW-EPR pozorované v kondenzované fázi TEMPOL-122-αS odráží interakci proteinu s polykationty, provedli jsme EPR titraci, abychom vyhodnotili vazebnou afinitu aS k různým polykationtům v nepřítomnosti LLPS (žádná akumulace Buffer LLPS), což naznačuje, že interakce jsou stejné ve zředěné a koncentrované fázi (což potvrzují naše data, doplňkový obr. 4a a doplňkový obr. 6).Cílem bylo zjistit, zda všechny koacerváty, navzdory jejich společným vlastnostem podobným tekutinám, vykazují nějaké základní odlišné chování na molekulární úrovni.Jak se očekávalo, spektrum EPR se rozšířilo se zvyšující se koncentrací polykationtů, což odráží pokles molekulární flexibility v důsledku molekulárních interakcí všech interakčních partnerů téměř k nasycení (obr. 3e, doplňkový obr. 6).pLK dosáhl této saturace při nižším molárním poměru (polykation:αS) ve srovnání s ANt-Tau a Tau441.Ve skutečnosti srovnání dat s přibližným vazebným modelem za předpokladu n identických a nezávislých vazebných míst ukázalo, že zdánlivá disociační konstanta pLK (~5 μM) je řádově nižší než tau441 nebo ΔNt-Tau (~50 μM ).uM).Ačkoli se jedná o hrubý odhad, naznačuje to, že aS má vyšší afinitu pro jednodušší polykationty se spojitými oblastmi kladného náboje.Vzhledem k tomuto rozdílu v afinitě mezi αS a různými polykationty jsme předpokládali, že jejich vlastnosti kapaliny se mohou v průběhu času měnit různě, a tak trpět různými procesy LSPT.
Vzhledem k vysoce přeplněnému prostředí uvnitř proteinového koacervátu a amyloidní povaze proteinu jsme pozorovali chování koacervátu v průběhu času, abychom detekovali možné procesy LSPT.Pomocí BF a CF mikroskopie (obrázek 4) jsme pozorovali, že αS/Tau441 koacervuje do značné míry v roztoku a tvoří velké kapičky, které kontaktují a smáčejí povrch na dně jamky/sklíčka jako plné kapičky, jak se očekávalo (doplňkový obr. 7d);tyto struktury vytvořené na dně nazýváme „proteinové vory“.Tyto struktury zůstaly tekuté, protože si zachovaly schopnost fúze (doplňkový obrázek 7b) a bylo možné je vidět několik hodin po spuštění LLPS (obr. 4 a doplňkový obrázek 7c).Pozorovali jsme, že proces smáčení je upřednostňován na povrchu hydrofilních spíše než hydrofobních materiálů (doplňkový obr. 7a), jak se očekává u elektrostatických koacervátů s nevyváženými náboji, a tedy vysokými elektrostatickými povrchovými potenciály.Je pozoruhodné, že koalescence a rafting αS/ANt-Tau byly významně sníženy, zatímco kondenzáty αS/pLK byly významně sníženy (obr. 4).Během krátké inkubační doby byly kapičky αS/pLK schopny srůst a smáčet hydrofilní povrch, ale tento proces se rychle zastavil a po 5 hodinách inkubace byly pozorovány pouze omezené jevy koalescence a žádné smáčení.– přechod gel-drip.
Reprezentativní mikroskopické snímky BF (panely ve stupních šedi) a CF (pravé panely, AF488-značený aS zeleně) koacervátových vzorků obsahujících 100 µM αS (1% fluorescenční značka) v LLPS pufru v přítomnosti 100 µM Tau441 (horní) fluorescence) ΔNt -Tau (uprostřed) nebo 1 mM pLK (dole) při různých inkubačních časech a ohniskových výškách (z, vzdálenost ode dna jamky destičky).Experimenty byly opakovány 4-6krát nezávisle na sobě se stejnými výsledky.Koacerváty αS/Tau441 se navlhčí po 24 hodinách a vytvoří rafty větší než na obrázku.Měřítko pro všechny obrázky je 20 µm.
Poté jsme se zeptali, zda by velké proteinové pooly podobné tekutině vytvořené v αS/Tau441 LLPS vedly k amyloidní agregaci některého ze studovaných proteinů.Sledovali jsme zrání kapiček αS/Tau441 v průběhu času pomocí WF mikroskopie za stejných podmínek jako výše, ale s použitím 1 uM αS značeného AF488 a Tau441 značeného Atto647N (obr. 5a).Jak se očekávalo, pozorovali jsme úplnou lokalizaci proteinu během procesu zrání.Zajímavé je, že od cca.Po 5 hodinách byly uvnitř raftů pozorovány intenzivnější nekruhové struktury, které jsme nazývali „body“, z nichž některé byly kolokalizovány s αS a některé byly obohaceny o Tau441 (obr. 5a, bílé šipky).Tyto skvrny byly vždy pozorovány v raftech ve větší míře pro αS/ANt-Tau než pro αS/ANt-Tau.V kapičkách systémů pLK a Tau nebyly žádné zřetelné skvrny nekompetentní pro fúzi/smáčení.Abychom otestovali, zda jsou tyto skvrny obsahující αS a Tau441 agregáty podobné amyloidu, provedli jsme podobný experiment pomocí CF mikroskopie, ve které byl Tau441 označen Atto647N a od začátku bylo přidáno 12,5 μM amyloid-specifického thioflavinu-T (ThT).barvivo.Ačkoli ThT-barvení kapiček nebo raftů αS/Tau441 nebylo pozorováno ani po 24 hodinách inkubace (obr. 5b, horní řada – zbývající kapičky nad proteinovými rafty), ThT-pozitivní struktury obsahující Atto647N-Tau441 uvnitř raftů byly velmi slabé.to replikuje velikost, tvar a umístění dříve popsaných skvrn (obr. 5b, střední a spodní řada), což naznačuje, že skvrny mohou odpovídat agregátům podobným amyloidu vytvořeným v koacervátech stárnoucích kapalin.
WF 25 μM αS v různých dobách inkubace a ohniskových výškách (z, vzdálenost od nenavázaného dna) v přítomnosti 25 μM Tau441 (1 μM αS značený AF488 a Tau441 značený Atto647N) v jamce mikroskopické destičky s pufrem LLPS) .Šest experimentů bylo nezávisle opakováno s podobnými výsledky.b CF mikroskopický snímek 25 μM αS v přítomnosti 25 μM Tau441 (1 μM Tau441 značený Atto647N) a 12,5 μM thioflavinu-T (ThT).Zvážené proteinové kapičky a usazené proteinové rafty a skvrny jsou zobrazeny v horní a střední řadě.Spodní řádek ukazuje obrázky raftů a dropů ze 3 nezávislých replikací.Bílé šipky označují ThT-pozitivní tečky v obou panelech.Měřítko pro všechny obrázky je 20 µm.
Abychom podrobněji prozkoumali změny v koacervátové proteinové síti během přechodu z kapaliny na pevnou látku, použili jsme fluorescenční celoživotní zobrazování (FLIM) a Försterovu rezonanční mikroskopii přenosu energie (FRET) (obrázek 6 a doplňkové obrázky 8 a 9).Předpokládali jsme, že koacervátové zrání vrstvy do kondenzovanější nebo dokonce pevné agregované proteinové struktury vede k užšímu kontaktu mezi proteinem a fluorescenční sondou, která je k němu připojena, což potenciálně vytváří zhášecí efekt projevující se zkrácenou životností sondy (τ) , jak bylo popsáno dříve40.,41,42.Navíc u dvojitě značených vzorků (AF488 a Atto647N jako FRET donorová a akceptorová barviva, v tomto pořadí) může být toto snížení τ také doprovázeno koacervátovou kondenzací a zvýšením účinnosti FRET(E) během LSPT.Monitorovali jsme tvorbu raftu a skvrn v průběhu času ve vzorcích LLPS aS/Tau441 a aS/ANt-Tau (25 uM každého proteinu v LLPS pufru obsahujícím 1 uM AF488 značeného aS a/nebo Atto647N značeného Tau441 nebo ANt-Tau).Pozorovali jsme obecný trend v tom, že životnost fluorescence sond AF488 (τ488) a Atto647N (τ647N) se mírně snížila, jak koacerváty dozrávaly (obr. 6 a doplňkový obr. 8c).Je zajímavé, že tato změna byla významně zesílena pro body v raftech (obr. 6c), což ukazuje, že na tečkách docházelo k další kondenzaci proteinů.Na podporu toho nebyla pozorována žádná významná změna v životnosti fluorescence u kapiček αS/ANt-Tau stárnutých po dobu 24 hodin (doplňkový obrázek 8d), což naznačuje, že gelovatění kapiček je proces odlišný od bodování a není doprovázen významnou molekulární reorganizací v koacervátech.Je třeba poznamenat, že tečky mají různé velikosti a proměnný obsah v αS, zejména pro systém αS/Tau441 (doplňkový obr. 8e).Snížení životnosti spotové fluorescence bylo doprovázeno zvýšením intenzity, zejména pro Tau441 značeného Atto647N (doplňkový obrázek 8a), a vyšší účinností FRET pro systémy αS/Tau441 a αS/ΔNt-Tau, což naznačuje další kondenzaci v LLPS Pět hodin po spuštění proteiny uvnitř statické elektřiny kondenzovaly.Ve srovnání s αS/ΔNt-Tau jsme pozorovali nižší hodnoty τ647N a poněkud vyšší hodnoty τ488 ve spotech αS/Tau441, doprovázené nižšími a nehomogenními hodnotami FRET.Možná to může souviset se skutečností, že v systému αS/Tau441 je pozorovaná a očekávaná abundance αS v agregátech heterogennější, často substechiometrická ve srovnání s Tau, protože samotný Tau441 může také podléhat LLPS a agregaci (doplňkový obrázek 8e) .Stupeň koalescence kapiček, tvorby raftů a, což je důležité, agregace proteinů v koacervátech podobných kapalinám je však maximální, když jsou přítomny Tau441 i aS.
a Snímky αS/Tau441 a αS/ANt-Tau po dobu životnosti fluorescenční mikroskopie (FLIM) při 25 μM každého proteinu (1 μM αS značený AF488 a 1 μM Tau441 nebo ANLLPS značený Tau441 nebo ANLLPS Tau 1 μM Atto647N).Sloupce ukazují reprezentativní snímky vzorků LLPS v různých dobách zrání (30 min, 5 h a 24 h).Červený rámeček ukazuje oblast obsahující body αS/Tau441.Životnost je zobrazena jako barevné pruhy.Měřítko = 20 µm pro všechny obrázky.b Přiblížený snímek FLIM vybrané oblasti, zobrazený v červeném rámečku na panelu a.Rozsahy životnosti jsou zobrazeny pomocí stejné barevné škály jako na panelu a.Měřítko = 5 um.c Histogramy ukazující AF488 (připojený k αS) nebo Atto647N (připojený k Tau) pro různé druhy proteinů (kapky-D-, raft-R- a speckle-P) identifikované na snímcích FLIM zaznamenaných pro αS-) distribuce časování životnost Tau441 a Vzorky koacervátu aS/ANt-Tau (N = 17-32 ROI pro D, 29-44 ROI pro R a 21-51 ROI pro body).Střední a střední hodnoty jsou zobrazeny jako žluté čtverce a černé čáry uvnitř rámečků.Dolní a horní hranice rámečku představují první a třetí kvartil a minimální a maximální hodnoty v rámci 1,5násobného mezikvartilového rozsahu (IQR) jsou zobrazeny jako vousy.Odlehlé hodnoty jsou zobrazeny jako černé diamanty.Statistická významnost mezi dvojicemi distribucí byla stanovena pomocí dvouvýběrového t-testu za předpokladu nestejných rozptylů.Dvoustranné p-hodnoty t-testu jsou uvedeny s hvězdičkami pro každý pár porovnávaných dat (* p-hodnota > 0,01, ** p-hodnota > 0,001, *** p-hodnota > 0,0001, **** p-hodnota > 0,00001), ns Označuje zanedbatelnost (p-hodnota > 0,05).Přesné hodnoty p jsou uvedeny v doplňkové tabulce 1 a původní data jsou prezentována jako soubory nezpracovaných dat.
Abychom dále demonstrovali povahu skvrn/agregátů podobnou amyloidu, ošetřili jsme neobarvené vzorky koacervátů po dobu 24 hodin vysokými koncentracemi (1 M) NaCl, což vedlo k oddělení agregátů od proteinových koacervátů.Když byly izolované agregáty (tj. dispergovaný roztok agregátů) pozorovány pomocí mikroskopie atomárních sil (AFM), pozorovali jsme převážně sférickou morfologii s pravidelnou výškou asi 15 nm, která má tendenci asociovat za podmínek vysoké koncentrace soli, podobně jako chování typických amyloidních fibril v důsledku silného hydrofobního účinku na povrchu (všimněte si, že fibrily mají typicky výšku ~10 nm) (doplňkový obrázek 10a).Je zajímavé, že když byly izolované agregáty inkubovány s ThT ve standardním fluorescenčním testu ThT, pozorovali jsme dramatický nárůst kvantového výtěžku fluorescence ThT, srovnatelný s tím, který byl pozorován, když bylo barvivo inkubováno s typickými aS amyloidovými fibrilami (doplňkový obrázek 10b), což naznačuje, že koacervátové agregáty obsahují struktury podobné amyloidu..Ve skutečnosti byly agregáty tolerantní k vysokým koncentracím soli, ale citlivé na 4 M guanidinchlorid (GdnHCl), jako typické amyloidní fibrily (doplňkový obrázek 10c).
Dále jsme analyzovali složení agregátů pomocí fluorescence jedné molekuly, specifické fluorescenční korelační/křížové korelační spektroskopie (FCS/FCCS) a burst analýzy dvoubarevné koincidenční detekce (TCCD).Za tímto účelem jsme izolovali agregáty vytvořené po 24 hodinách inkubace ve 100 μl vzorcích LLPS obsahujících αS a Tau441 (oba 25 μM) spolu s 1 μM αS značeným AF488 a 1 μM Tau441 značeným Atto647N.Zřeďte výsledný roztok dispergovaného agregátu do monomolekulárního stavu pomocí stejného pufru bez PEG a 1 M NaCl (stejný pufr, jaký se používá k separaci agregátů od koacervátu), aby se zabránilo jakýmkoli možným elektrostatickým interakcím mezi LLPS a proteinem.Příklad časové trajektorie jedné molekuly je vidět na obr. 7a.FCCS/FCS analýza (křížová korelace, CC a autokorelace, AC) ukázala, že agregáty obsahující αS a tau byly ve vzorcích hojné (viz křivka CC na obr. 7b, levý panel) a přebytek zbytkového monomerního proteinu vznikl jako výsledek procesu ředění (viz AC křivky na obrázku 7b, levý panel).Kontrolní experimenty provedené za stejných podmínek roztoku s použitím vzorků obsahujících pouze monomerní proteiny neukázaly žádné CC křivky a AC křivky dobře zapadají do jednosložkového difúzního modelu (Rov. 4), kde monomerní proteiny mají očekávané difúzní koeficienty (obr. 7b). ), pravý panel).Difúzní koeficient agregovaných částic je menší než 1 µm2/s a difúzní koeficient monomerních proteinů je asi 1 µm2/s.50–100 µm/s;hodnoty jsou podobné dříve publikovaným hodnotám pro sonikované αS amyloidní fibrily a monomerní αS samostatně za podobných podmínek roztoku44.Když jsme agregáty analyzovali analýzou výbuchu TCCD (obr. 7c, horní panel), zjistili jsme, že v každém izolovaném agregátu (aS/Tau heteroagregát) asi 60 % detekovaných agregátů obsahovalo jak αS, tak tau, asi 30 % obsahovalo pouze tau, pouze asi 10 % αS.Stechiometrická analýza heteroagregátů αS/Tau ukázala, že většina heteroagregátů byla obohacena o tau (stechiometrie pod 0,5, průměrný počet molekul tau na agregát je 4krát více než molekul αS), což je v souladu s naší prací pozorovanou ve FLIM in situ experimenty..Analýza FRET ukázala, že tyto agregáty obsahovaly oba proteiny, i když skutečné hodnoty FRET v tomto případě nemají velký význam, protože distribuce fluoroforů v každém agregátu byla náhodná kvůli přebytku neznačeného proteinu použitého v experimentu.Je zajímavé, že když jsme provedli stejnou analýzu s použitím varianty Tau 45,46 s deficitem zralé agregace amyloidu (viz doplňkový obrázek 11a,b), všimli jsme si, že ačkoli elektrostatická agregace αS byla stejná (doplňkový obrázek 11c, d), schopnost tvořit agregáty v koacervátu byla drasticky snížena a FLIM detekoval několik bodů v experimentech in situ a slabé křivky vzájemné korelace byly pozorovány pro izolované vzorky agregátů.U malého počtu detekovaných agregátů (pouze jedna desetina Tau441) jsme však pozorovali, že každý agregát byl obohacen o αS než tato varianta Tau, přičemž přibližně 50 % detekovaných agregátů obsahovalo pouze molekuly αS a αS byl v přebytku heterogenní. .agregáty (viz doplňkový obr. 11e), na rozdíl od heterogenních agregátů generovaných Tau441 (obr. 6f).Výsledky těchto experimentů ukázaly, že ačkoli samotný αS je schopen akumulovat se s tau v koacervátu, nukleace tau je za těchto podmínek příznivější a výsledné agregáty podobné amyloidu jsou schopny působit jako forma αS a tau.Jakmile je však vytvořeno jádro bohaté na tau, heterotypické interakce mezi aS a tau jsou zvýhodněny v agregátech před homotypickými interakcemi mezi molekulami tau;také pozorujeme proteinové sítě v kapalných αS/tau koacervátech.
a Reprezentativní fluorescenční časové stopy jednotlivých molekul izolovaných agregátů vytvořených v elektrostatických koacervátech aS/Tau441.Výbuchy odpovídající koagregátům αS/Tau441 (výbuchy nad uvedenou prahovou hodnotou) byly pozorovány ve třech detekčních kanálech (emise AF488 a Atto647N po přímé excitaci, modré a červené čáry, emise Atto647N po nepřímé excitaci), FRET, fialová čára).b FCS/FCCS analýza vzorku izolovaných agregátů aS/Tau441 získaných z LLPS (levý panel).Autokorelační (AC) křivky pro AF488 a Atto647N jsou zobrazeny modře a červeně a křivky křížové korelace (CC) spojené s agregáty obsahujícími obě barviva jsou zobrazeny fialově.AC křivky odrážejí přítomnost značených monomerních a agregovaných proteinových druhů, zatímco CC křivky ukazují pouze difúzi dvojitě značených agregátů.Stejná analýza, ale za stejných podmínek roztoku jako v izolovaných skvrnách, vzorky obsahující pouze monomerní aS a Tau441 jsou zobrazeny jako kontroly na pravém panelu.c Fluorescenční flash analýza jednotlivých molekul izolovaných agregátů vytvořených v elektrostatických koacervátech αS/Tau441.Informace pro každý agregát nalezený ve čtyřech různých opakováních (N = 152) jsou vyneseny proti jejich stechiometrii, hodnotám S a účinnosti FRET (horní panel, barevný pruh odráží výskyt).Lze rozlišit tři typy agregátů: -aS-pouze agregáty s S~1 a FRET~0, Tau-pouze agregáty s S~0 a FRET~1 a heterogenní Tau/aS agregáty s meziprodukty S a FRET Odhady množství obou markerových proteinů detekovaných v každém heterogenním agregátu (N = 100) jsou uvedeny ve spodním panelu (výskyt odráží barevná škála).Nezpracovaná data jsou poskytována ve formě souborů nezpracovaných dat.
Zrání nebo stárnutí kapalných proteinových kondenzátů do gelovitých nebo pevných struktur v průběhu času bylo hlášeno jako zapojeno do několika fyziologických funkcí kondenzátu47 a také do onemocnění, jako abnormální proces předcházející agregaci amyloidu 7, 48, 49. Zde podrobně studujeme fázovou separaci a chování.LSPT αS v přítomnosti náhodných polykationtů v kontrolovaném prostředí při nízkých mikromolárních koncentracích a fyziologicky relevantních podmínkách (všimněte si, že vypočítaná fyziologická koncentrace αS je >1 µM50), po typickém termodynamicky řízeném chování LPS.Zjistili jsme, že αS, který obsahuje vysoce negativně nabitou C-terminální oblast při fyziologickém pH, je schopen tvořit kapičky bohaté na proteiny ve vodném roztoku prostřednictvím LLPS v přítomnosti vysoce kationtových neuspořádaných peptidů, jako jsou pLK nebo Tau, prostřednictvím procesu elektrostatického komplexní kondenzace v přítomnosti agregačních makromolekul.Tento proces může mít relevantní účinky v buněčném prostředí, kde se aS setkává s různými polykationtovými molekulami spojenými s jeho agregací spojenou s onemocněním jak in vitro, tak in vivo51,52,53,54.
V mnoha studiích byla dynamika proteinů v kapkách považována za jeden z klíčových faktorů určujících proces zrání55,56.V elektrostatických αS koacervátech s polykationty proces zrání zjevně závisí na síle interakcí s polykationty, valenci a multiplicitě těchto interakcí.Teorie rovnováhy naznačuje, že rovnovážnou krajinou dvou kapalných stavů by byla přítomnost velké kapičky bohaté na biopolymery, které pohánějí LLPS57,58.Růstu kapek lze dosáhnout Ostwaldovým zráním59, koalescencí60 nebo spotřebou volného monomeru v dispergované fázi61.Pro aS a Tau441, ANt-Tau nebo pLK byla většina proteinu koncentrována v kondenzátu za podmínek použitých v této studii.Zatímco však kapičky tau v plné velikosti po smáčení povrchu rychle splývaly, koalescence a smáčení kapiček byly pro ANt-Tau a pLK obtížné, což naznačuje rychlou ztrátu vlastností kapaliny v těchto dvou systémech.Podle naší analýzy FLIM-FRET vykazovaly staré kapičky pLK a ANt-Tau podobný stupeň agregace proteinu (podobná životnost fluorescence) jako původní kapičky, což naznačuje, že původní proteinová síť byla zachována, i když pevnější.
Naše experimentální výsledky racionalizujeme v následujícím modelu (obrázek 8).Původně dočasně vytvořené kapičky jsou často proteinové sítě bez elektrostatické kompenzace, a proto existují oblasti nábojové nerovnováhy, zejména na rozhraní kapiček, což vede ke kapkám s vysokým elektrostatickým povrchovým potenciálem.Pro kompenzaci náboje (jev běžně označovaný jako deplece valence) a minimalizaci povrchového potenciálu kapiček mohou kapičky zahrnovat nové polypeptidy ze zředěné fáze, reorganizovat proteinové sítě pro optimalizaci interakcí náboj-náboj a interagovat s jinými kapičkami.s povrchy (smáčení).Zdá se, že kapičky αS/pLK jsou díky své jednodušší proteinové síti (pouze heterotypické interakce mezi αS a pLK) a větší afinitě k interakcím protein-protein schopny vyrovnat náboj kondenzátu rychleji;skutečně jsme pozorovali rychlejší kinetiku proteinů v původně vytvořených koacervátech αS/pLK než v αS/Tau.Po vyčerpání valence se interakce stávají méně pomíjivé a kapičky ztrácejí své kapalné vlastnosti a mění se na gelovité, nehořlavé kapičky s nízkým elektrostatickým povrchovým potenciálem (a tudíž neschopné smáčet povrch).Naproti tomu kapičky αS/Tau jsou méně účinné při optimalizaci rovnováhy náboje kapiček kvůli složitějším proteinovým sítím (s homotypickými i heterotypickými interakcemi) a slabší povaze proteinových interakcí.To má za následek kapičky, které si zachovávají chování kapaliny po dlouhou dobu a vykazují vysoký elektrostatický povrchový potenciál, který má tendenci být minimalizován slučováním a růstem (čímž se minimalizuje poměr povrch/objem kapiček) a smáčením hydrofilního povrchu chem.To vytváří velké koncentrované proteinové knihovny, které si zachovávají tekuté vlastnosti, protože interakce zůstávají velmi přechodné díky neustálému hledání optimalizace náboje v proteinové síti.Je zajímavé, že N-koncově zkrácené formy Tau, včetně některých přirozeně se vyskytujících izoforem62, vykazují přechodné chování, přičemž některé koacerváty stárnou s αS na gelovité kapičky s dlouhou životností, zatímco jiné se přeměňují na velké kapalné kondenzáty.Tato dualita ve zrání αS elektrostatických koacervátů je v souladu s nedávnými teoretickými a experimentálními studiemi LLPS, které identifikovaly korelaci mezi valenčním vyčerpáním a elektrostatickým proséváním v kondenzátech jako klíč k řízení velikosti kondenzátu a vlastností tekutin.Mechanismus 58,61.
Toto schéma ukazuje předpokládanou dráhu agregace amyloidu pro aS a Tau441 prostřednictvím LLPS a LSPT.S dalšími oblastmi bohatými na anionty (červená) a bohatými na kationty (modrá) mají elektrostatické koacerváty αS a tau s uspokojivou valencí nižší povrchovou energii, a proto menší koalescenci, což má za následek rychlé stárnutí kapek.Je dosaženo stabilního neaglomerovaného gelového stavu..Tato situace je velmi příznivá v případě systému αS/pLK díky jeho vyšší afinitě a jednodušší síti interakcí protein-pár, která umožňuje rychlý gelovitý přechod.Naopak, kapičky s neuspokojivou valencí, a tudíž proteinem nabité oblasti dostupné pro interakci, usnadňují koacervátu fúzi a smáčení hydrofilního povrchu, aby se snížila jeho vysoká povrchová energie.Tato situace je výhodnější pro koacerváty αS/Tau441, které mají multivalentní komplexní síť sestávající ze slabých interakcí Tau-Tau a αS-Tau.Větší koacerváty si zase snáze udrží své vlastnosti podobné tekutině, což umožní další interakce protein-protein.Nakonec se v koacervátní tekutině tvoří amyloidní heterogenní agregáty obsahující jak aS, tak tau, které mohou souviset s agregáty nalezenými v inkluzních tělíscích, což jsou charakteristické znaky neurodegenerativních onemocnění.
Velké tekutiny podobné struktury vytvořené během zrání αS/Tau441 s vysoce přetíženým, ale dynamickým proteinovým prostředím a v menší míře koacerváty αS/ANt-Tau jsou ideálními rezervoáry pro nukleaci agregace proteinů.Skutečně jsme pozorovali tvorbu pevných proteinových agregátů v tomto typu proteinových koacervátů, často obsahujících jak aS, tak tau.Ukázali jsme, že tyto heteroagregáty jsou stabilizovány neelektrostatickými interakcemi, jsou schopny vázat amyloid-specifická ThT barviva stejným způsobem jako typické amyloidní fibrily a skutečně mají podobnou odolnost vůči různým vlivům.Ukázalo se, že agregáty aS/tau vytvořené pomocí LLPS mají vlastnosti podobné amyloidu.Ve skutečnosti je zralá varianta Tau deficitní v agregaci amyloidu významně narušena při tvorbě těchto heterogenních agregátů aS v kapalném elektrostatickém koacervátu.Tvorba agregátů αS/Tau441 byla pozorována pouze uvnitř koacervátů, které si zachovaly vlastnosti podobné kapalině, a nikdy, pokud koacerváty/kapky nedosáhly gelového stavu.V druhém případě zvýšená síla elektrostatických interakcí a v důsledku toho rigidita proteinové sítě brání nezbytným konformačním přeskupením proteinů k vytvoření nových proteinových interakcí nezbytných pro nukleaci amyloidu.Toho však lze dosáhnout ve pružnějších, kapalině podobných koacervátech, u kterých je zase pravděpodobnější, že zůstanou tekuté, když se zvětší.
Skutečnost, že tvorba agregátů v kondenzované fázi je výhodnější ve velkých kondenzátech αS/Tau než v malých kapičkách, které rychle gelovatí, zdůrazňuje význam identifikace faktorů, které řídí koalescenci kapiček.Existuje tedy nejen tendence k separaci fází, ale velikost kondenzátu musí být kontrolována pro správné fungování a také pro prevenci onemocnění58,61.Naše výsledky také zdůrazňují důležitost rovnováhy mezi LLPS a LSPT pro systém αS/Tau.Zatímco tvorba kapiček může chránit před agregací amyloidu snížením množství proteinových monomerů dostupných za podmínek nasycení, jak bylo navrženo v jiných systémech63,64, kapičková fúze při vysokých hladinách kapiček může vést k vnitřní agregaci proteinů prostřednictvím pomalých konformačních přestaveb.proteinové sítě..
Celkově naše data silně zdůrazňují význam kohezivní valence a spokojených/neuspokojených interakcí v drop sítích v kontextu LSPT.Konkrétně ukazujeme, že kondenzáty aS/Tau441 plné délky jsou schopny účinně fúzovat a nukleovat za vzniku heteroagregátů podobných amyloidu, které zahrnují oba proteiny, a navrhují molekulární mechanismus založený na našich experimentálních výsledcích.Společná agregace dvou proteinů v tekutém koacervátu αS/Tau, kterou zde uvádíme, může skutečně souviset se společnou lokalizací dvou proteinů v inkluzích, které jsou charakteristickým znakem onemocnění, a může přispět k pochopení vztahu mezi LLPS a amyloid agregace, dláždit cestu pro vysoce nabité IDP v neurodegeneraci.
Monomerní WT-αS, cysteinové mutanty (Q24C-αS, N122C-αS) a ACt-αS varianty (A101-140) byly exprimovány v E. coli a purifikovány, jak bylo popsáno dříve.5 mM DTT bylo zahrnuto ve všech krocích při čištění aS cysteinových mutantů, aby se zabránilo tvorbě disulfidových vazeb.Izoforma Tau441 (plazmid získaný z Addgene #16316), varianta ΔNt-Tau (Δ1–150, získaná klonováním IVA s primery CTTTAAGAAGGAGATACATATGATCGCCACACCGCGG, CATATGTATATCCTCTCTTCTTAAAGTTAAAC) a purifikovaná primer GΔG2Tau, varianta GΔCTliTau s GΔG1Ta5u kultury byly růst na OD600 = 0,6–0,7 při 37 °C a 180 ot./min. a exprese byla indukována pomocí IPTG po dobu 3 hodin při 37 °C.Sklízejte buňky při 11 500 xg po dobu 15 minut při 4 °C a promyjte fyziologickým roztokem obsahujícím 150 mM NaCl.Resuspendujte peletu v lyzačním pufru (20 ml na 1 1 LB: MES 20 mM, pH 6,8, NaCl 500 mM, EDTA 1 mM, MgCl2 0,2 ​​mM, DTT 5 mM, PMSF 1 mM, benzamidin coptin 50 μM10 μM).Krok sonikace byl proveden na ledu s amplitudou 80 % po dobu 10 pulzů (1 min zapnuto, 1 min vypnuto).Nepřekračujte 60 ml na jeden ultrazvuk.Lyzáty E. coli byly zahřívány na 95 °C po dobu 20 minut, potom ochlazeny na ledu a odstřeďovány při 127 000 x g po dobu 40 minut.Vyčeřený supernatant byl nanesen na 3,5 kDa membránu (Spectrum™ Thermo Fisher Scientific, UK) a dialyzován proti 4 1 dialyzačního pufru (20 mM MES, pH 6,8, NaCl 50 mM, EDTA 1 mM, MgCl2 2 mM, DTT 2 mM PMSF 0,1 mM) po dobu 10 hodin.5ml kationtoměničová kolona (HiTrap SPFF, Cytiva, MA, USA) byla ekvilibrována ekvilibračním pufrem (20 mM MES, pH 6,8, 50 mM NaCl, 1 mM EDTA, 2 mM MgCl2, 2 mM DTT, 0,1 mM PMSF).Tau lyzát byl filtrován přes 0,22 um PVDF filtr a vstřikován do kolony při průtoku 1 ml/min.Eluce byla prováděna postupně, tau byl eluován 15–30% elučním pufrem (20 mM MES, pH 6,8, 1 M NaCl, 1 mM EDTA, 2 mM MgCl2, 2 mM DTT, 0,1 mM PMSF).Frakce byly analyzovány pomocí SDS-PAGE a jakékoli frakce obsahující jeden pás s očekávanou molekulovou hmotností tau byly koncentrovány pomocí 10 kDa centrifugačního filtru a nahrazeny pufrem obsahujícím 10 mM HEPES, pH 7,4, NaCl 500 mM a DTT 2 mM pro konečná koncentrace proteinu byla 100 uM.Proteinový roztok pak prošel 0,22 um PVDF filtrem, rychle zmrazil a skladoval při -80 °C.Protein K18 laskavě poskytl Prof. Alberto Boffi.Čistota přípravku byla >95 %, jak bylo potvrzeno SDS-PAGE a MALDI-TOF/TOF.Různé cysteiny byly chemicky značeny AlexaFluor488-maleimidem (AF488, ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, USA) nebo TEMPOL-maleimidem (Toronto Research Chemicals, Toronto, Kanada).byly potvrzeny absorbancí a MALDI-TOF/TOF.Tau441, ANt-Tau, AggDef-Tau a K18 byly značeny nativními cysteinovými zbytky v pozicích 191 a 322 pomocí Atto647N-maleimidu (ATTO-TEC GmbH, Siegen, Německo) podle stejného postupu.Mapy čistého náboje na zbytek pro aS a Tau441 byly vytvořeny pomocí CIDER66.
Pevný poly-L-lysin (pLK DP 90-110 podle NMR od dodavatele, Alamanda Polymers Inc, Huntsville, Alabama, USA) byl rozpuštěn v 10 mM HEPES, 100 mM NaCl, pH 7,4 až 10 mM koncentrace, proces sonikován po dobu 5 minut v ultrazvukové vodní lázni a skladujte při -20°C.PEG-8, dextran-70, FITC-PEG-10 (Biochempeg, Watertown, MA, USA) a FITC-dextran-500 (Sigma-Aldrich, Sant Louis, MI, USA) jsou ve vodě rozpustné a široce distribuované v pufru LLPS.Dialýza odstraňuje kontaminující soli.Poté byly filtrovány přes injekční filtr s velikostí pórů 0,22 μm a jejich koncentrace byly vypočteny pomocí refraktometru (Mettler Toledo, Columbus, Ohio, USA).Vzorky LLPS byly připraveny při pokojové teplotě v následujícím pořadí: pufr a extruze byly smíchány a 1 mM tris(2-karboxyethyl)fosfin (TCEP, Carbosynth, Compton, UK), 1 mM 2,2,2,2-(Ethan- kyselina 1,2-diyldinitril)tetraoctová (EDTA, karboxynth) a směs 1% inhibitoru proteázy (PMSF 100 mM, benzimid 1 mM, leupeptin 5 uM).Poté se přidá αS a fúzované polykationty (možnosti pLK nebo Tau).Pro experimenty s časovou řadou thioflavinu-T (ThT, Carbosynth, Compton, UK) použijte celkovou koncentraci ThT jako polovinu koncentrace αS.Jemně, ale důkladně vzorky promíchejte, abyste zajistili, že jsou homogenní.Koncentrace každé složky se lišila experiment od experimentu, jak je popsáno v části Výsledky.Azid byl použit v koncentraci 0,02 % (hmotn./obj.), kdykoli doba trvání experimentu přesáhla 4 hodiny.U všech analýz s použitím vzorků LLPS nechte směs před analýzou 5 minut ekvilibrovat.Pro analýzu rozptylu světla bylo 150 ul vzorků naneseno na nevazbové 96jamkové mikrodestičky (uClear®, černá, F-Bottom/Chimney Well, Greiner bio-one, Kremsmünster, Rakousko) a pokryty adhezivním filmem.LLP byly monitorovány měřením absorbance při 350 nm ve středu roztoku ve čtečce destiček CLARIOstar (BMG Labtech, Ortenberg, Německo).Experimenty byly provedeny trojmo při 25 °C a chyby byly vypočteny jako standardní odchylka od průměru.Zředěná fáze byla kvantifikována centrifugací vzorku a gelovou analýzou SDS-PAGE a frakce aS ve zředěné a koncentrované fázi byla kvantifikována v různých roztocích LLPS.Vzorek 100 μl LLPS obsahující 1 μM AF488-značený aS byl připraven důkladným promícháním následovaným centrifugací při 9600 x g po dobu 30 minut, po které byla sraženina obvykle viditelná.Horních 50 ul supernatantu bylo použito pro kvantifikaci proteinu pomocí SDS-PAGE gelu.Gely byly skenovány pomocí filtrů AF488 s použitím gelového zobrazovacího systému ChemiDoc (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, USA) nebo byly obarveny barvivem Coomassie a vizualizovány pomocí vhodných filtrů.Výsledné pásy byly analyzovány pomocí ImageJ verze 1.53i (National Institutes of Health, USA).Experimenty byly provedeny duplicitně ve dvou různých experimentech s podobnými výsledky.
Typicky bylo 150 μl vzorků aplikováno na nevazbové 96jamkové mikrodestičky a vizualizováno při pokojové teplotě na inverzním mikroskopu Leica DMI6000B (Leica Microsystems, Wetzlar, Německo).Pro bodové experimenty byly také použity destičky u-Slide Angiogenesis (Ibidi GmbH, Gräfelfing, Německo) nebo 96-jamkové polystyrenové mikrodestičky (Corning Costar Corp., Acton, Massachusetts).Jako zdroje osvětlení byly použity halogenové nebo rtuťové halogenidové výbojky EL6000 (pro BF/DIC a WF zobrazování).Pro WF mikroskopii byl použit vzduchový objektiv se 40násobným zvětšením (Leica Microsystems, Německo) pro zaostření světla na vzorek a jeho sběr.U vzorků značených AF488 a ThT excitace a emise filtru se standardními sadami filtrů GFP, excitační a emisní pásmové filtry, v tomto pořadí, 460–500 nm a 512–542 nm pásmové filtry a 495 nm dichroické zrcadlo.Pro vzorky označené Atto647N byla použita standardní sada Cy5 filtrů s excitačními a emisními pásmovými filtry 628–40 nm a 692–40 nm a dichroické zrcadlo 660 nm.Pro mikroskopii BF a DIC použijte stejný objektiv pro sběr odraženého světla.Shromážděné světlo bylo zaznamenáno na CCD kameře Leica DFC7000 (Leica Microsystems, Německo).Expoziční čas byl 50 ms pro BF a DIC mikroskopické zobrazování a 20-100 ms pro WF mikroskopické zobrazování.Pro srovnání, doba expozice pro všechny experimenty s ThT byla 100 ms.Byly provedeny časosběrné experimenty pro vizualizaci koalescence kapiček, přičemž snímky byly shromažďovány každých 100 ms po dobu několika minut.Pro analýzu obrazu byl použit ImageJ (NIH, USA).Experimenty byly provedeny trojmo s podobnými výsledky.
Pro kolokalizační experimenty, FRAP a 3D rekonstrukci byly snímky pořízeny na inverzním konfokálním mikroskopu Zeiss LSM 880 za použití ZEN 2 blue edition (Carl Zeiss AG, Oberkochen, Německo).Vzorky o objemu 50 ul byly naneseny na Petriho misky µ-Slide Angiogenesis (Ibidi GmbH, Gröfelfing, Německo), ošetřeny hydrofilním polymerem (ibiTreat) a upevněny do objektivu s 63× olejovou imerzí (Plan-Apochromat 63×/NA 1,4 Oil) na DIC).Snímky byly pořízeny pomocí 458 nm, 488 nm a 633 nm argonových laserových linií s rozlišením 0,26 µm/pixel a dobou expozice 8 µs/pixel pro okna detekce excitace a emise 470–600 nm, 493–628 nm, a 638–755 nm bylo použito k vizualizaci ThT, AF488 a Atto647N, v daném pořadí.Pro experimenty FRAP byla časosběrná fotografie každého vzorku zaznamenána rychlostí 1 snímek za sekundu.Experimenty byly provedeny trojmo při teplotě místnosti s podobnými výsledky.Všechny obrázky byly analyzovány pomocí softwaru Zen 2 blue edition (Carl Zeiss AG, Oberkochen, Německo).Křivky FRAP byly normalizovány, vyneseny do grafu a přizpůsobeny datům intenzity/času extrahovaným ze snímků pomocí Zen 2 pomocí OriginPro 9.1.Křivky výtěžnosti byly přizpůsobeny monoexponenciálnímu modelu, aby se zohlednila molekulární difúze s dalším exponenciálním výrazem, který zohlednil účinek akvizičního bělení.Potom jsme vypočítali D pomocí nominálního poloměru bělení a dříve stanoveného poločasu obnovy jako v rovnici Kang et al.5 35 zobrazeno.
Jednotlivé cysteinové varianty aS byly syntetizovány s 4-hydroxy-2,2,6,6-tetramethylpiperidin-N-oxylem (TEMPOL) v pozicích 24 (TEMPOL-24-αS) a 122 (TEMPOL-122-αS), respektive.Spin Labeling Pro experimenty EPR byla koncentrace aS nastavena na 100 uM a koncentrace PEG byla 15 % (w/v).Pro různé podmínky agregace byl poměr aS:pLK 1:10, zatímco poměry aS:ANt-Tau a aS:Tau441 byly udržovány na 1:1.Pro experimenty s titrací vazby v nepřítomnosti shlukování byl TEMPOL-122-αS udržován na 50 uM a polykationty byly titrovány při zvyšujících se koncentracích, přičemž každá podmínka byla připravena samostatně.CW-EPR měření byla provedena pomocí spektrometru Bruker ELEXSYS E580 X-band vybaveného rezonátorem Bruker ER4118 SPT-N1 pracujícím na mikrovlnné (SHF) frekvenci ~9,7 GHz.Teplota byla nastavena na 25 °C a kontrolována kryostatem s kapalným dusíkem.Spektra byla získána za nenasycených podmínek při MW výkonu 4 mW, modulační amplitudě 0,1 mT a modulační frekvenci 100 kHz.Spektrální intenzity byly normalizovány, aby se zabránilo rozdílům v koncentracích spinů mezi vzorky a možné redukci spinu v důsledku zbytkových koncentrací redukčních činidel ve vzorcích obsahujících Tau441 nebo ANt-Tau (přítomné v původních proteinových roztocích).Uvedené hodnoty g byly získány jako výsledek EPR spektrálního modelování provedeného pomocí softwaru Easyspin (v. 6.0.0-dev.34) implementovaného v Matlab®67.K modelování dat byly použity jedno/dvousložkové izotropní modely.Po normalizaci všech signálů byly zbytky vypočteny odečtením každé simulace od odpovídajícího experimentálního spektra.Pro analýzu titrace vazby byla použita relativní intenzita třetího pásu k druhému pásu normalizovaného EPR spektra (IIII/III) ke sledování vazby polykationtů k aS.Pro odhad disociační konstanty (Kd) byla výsledná křivka přizpůsobena přibližnému modelu za předpokladu n identických a nezávislých vazebných míst.
Experimenty NMR spektroskopie byly prováděny za použití spektrometru Bruker Neo 800 MHz (1H) NMR vybaveného kryosondou a Z-gradientem.Všechny experimenty byly provedeny s použitím 130–207 uM αS a odpovídajících ekvivalentů αS/ANt-Tau a pLK v 10 mM HEPES, 100 mM NaCl, 10 % DO, pH 7,4 a byly prováděny při 15 °C.Pro monitorování LPS pomocí NMR bylo k předem smíchaným vzorkům přidáno 10% PEG.Graf poruch chemického posunu (obr. 1b) ukazuje průměrné chemické posuny 1H a 15N.Spektra aS 2D1H-15N HSQC byla přiřazena na základě předchozího přiřazení (položka BMRB #25227) a potvrzena záznamem a analýzou 3D spekter HNCA, HNCO a CBCAcoNH.Chemické posuny 13Cα a 13Cβ byly vypočteny v přítomnosti ANt-Tau nebo pLK, aby se změřily možné změny v trendech sekundární struktury ve srovnání s chemickými posuny aS v čisté konformaci náhodného klubka 68 (doplňkový obrázek 5c).Rychlosti R1ρ byly měřeny záznamem experimentů hsqctretf3gpsi (získaných z knihovny Bruker) se zpožděním 8, 36, 76, 100, 156, 250, 400 a 800 ms a exponenciální funkce byly upraveny na zpoždění maximální intenzity při různých krát k určení R1ρ a jeho experimentální nejistoty.
Experimenty s dvoubarevnou časově rozlišenou fluorescenční mikroskopií byly prováděny na komerčním časově rozlišeném fluorescenčním konfokálním mikroskopu MT200 (PicoQuant, Berlín, Německo) s časově korelovaným zařízením pro počítání jednotlivých fotonů (TCSPC).Hlava laserové diody se používá pro pulzně prokládané buzení (PIE), paprsek prochází jednovidovým vlnovodem a je naladěn na výkon laseru 10 až 100 nW pro laserové čáry 481 nm a 637 nm měřené po dichroickém zrcadle.To zajišťuje optimální rychlost počítání fotonů, čímž se zabrání efektům aliasingu fotonů, fotobělení a saturaci.Krycí sklíčka nebo destičky pro angiogenezi μ-Slide (Ibidi GmbH, Gräfelfing, Německo) byly umístěny přímo do imerzní vody přes čočku Super Apochromat 60x NA 1.2 s korekčním límcem (Olympus Life Sciences, Waltham, USA).Jako dělič hlavního paprsku bylo použito dichroické zrcadlo 488/640 nm (Semrock, Lake Forest, IL, USA).Nezaostřené záření je blokováno otvorem o průměru 50 mikronů, poté je zaostřené záření rozděleno na 2 detekční dráhy děličem paprsků 50/50.Před detektorem byly použity pásmové emisní filtry (Semrock, Lake Forest, IL, USA) 520/35 pro zelené barvivo (AF488) a 690/70 pro červené barvivo (Atto647N).Jako detektory byly použity jednofotonové lavinové diody (SPAD) (Micro Photon Devices, Bolzano, Itálie).Sběr dat i analýza byly provedeny pomocí komerčně dostupného softwaru SymphoTime64 (PicoQuant GmbH, Berlín, Německo).
Padesát mikrolitrů vzorků LLPS bylo aplikováno do jamek pro angiogenezi μ-Slide (Ibidi GmbH, Gräfelfing, Německo).Výsledné snímky jsou zaostřeny na 20 µm nad dnem jamky pro optimální objektivní pracovní vzdálenost pro suspendované kapičky a na ~1 µm pro rafty a body s axiálním rozlišením alespoň 0,25 µm/pixel a dobou zpoždění 400 µs/pixel.Vyberte data použitím prahové hodnoty intenzity založené na průměrné intenzitě signálu pozadí (PBG, průměr + 2σ) pro každý kanál tak, aby byly vybrány pouze kapičky tekutého proteinu, rafty nebo skvrny, čímž se odfiltruje jakýkoli možný původ z rozptýlené fáze.Abychom analyzovali životnost každého druhu (τ) každého kanálu (zelená, „g“ pro AF488 a červená, „r“ pro Atto647N), vybrali jsme oblasti zájmu (ROI) obsahující kapičky, rafty nebo skvrny (doplňkový obrázek 1 ).8b) a odvodili je přizpůsobením jejich rozpadu po dobu životnosti (τD, τR a τP pro kapičky, rafty nebo skvrny, v tomto pořadí, viz doplňkový obr. 8c) v každém kanálu pomocí analýzy ocasu a dvousložkového modelu rozpadu.Průměr τ z τ .ROI, které produkovaly příliš málo fotonů pro multiexponenciální fit, byly z analýzy vyloučeny.Použitý limit byl <104 fotonů pro rafty a tečky a 103 pro kapky.Kapky mají nižší práh, protože je obtížné získat křivky rozpadu s vyššími hodnotami intenzity, protože kapičky v obrazovém poli jsou obvykle menší a méně početné.Oblasti zájmu s počtem fotonů nad limitem akumulace fotonů (nastaveným na >500 impulzů/pixel) byly také vyřazeny pro analýzu.Porovnejte křivku poklesu intenzity získanou ze zájmové oblasti s intenzitou na 90 % maxima (mírně po maximální intenzitě poklesu) od začátku životnosti, abyste zajistili minimální rušení IRF při zachování stejné pro všechny poklesy intenzity nastavení Relativní časové okno Bylo analyzováno 25 až 50 ROI pro rafty a skvrny a 15-25 ROI pro kapky, snímky byly vybrány z více než 4 replikátů zaznamenaných z alespoň 3 nezávislých experimentů.K vyhodnocení statistických rozdílů mezi druhy nebo mezi koacervátovými systémy byly použity dvoustranné t-testy.Pro analýzu doby života (τ) pixel po pixelu byl vypočítán celkový útlum životnosti v poli pro každý kanál a byla provedena aproximace 2/3-složkového modelu exponenciálního útlumu.Útlum životnosti pro každý pixel byl poté přizpůsoben pomocí dříve vypočítaných hodnot τ, což vedlo k přizpůsobení obrazu pseudobarvy FLIM.Rozsah životnosti uložení ocasu byl stejný u všech snímků stejného kanálu a každý rozpad produkoval dostatek fotonů, aby bylo zajištěno spolehlivé uložení.Pro analýzu FRET byly pixely vybrány aplikací nižšího prahu intenzity 100 fotonů, který zprůměroval signál pozadí (FBG) 11 fotonů.Intenzita fluorescence každého kanálu byla korigována experimentálně stanovenými korekčními faktory: 69 spektrální přeslech α byl 0,004, přímá excitace β byla 0,0305, účinnost detekce γ byla 0,517.Účinnost FRET na úrovni pixelu se pak vypočítá pomocí následující rovnice:
kde FDD je intenzita fluorescence pozorovaná v donorovém (zeleném) kanálu, FDA je intenzita fluorescence pozorovaná v akceptorovém (červeném) kanálu při nepřímé excitaci a FAA je intenzita fluorescence pozorovaná v akceptorovém (červeném) kanálu při přímé excitaci ( KOLÁČ).Pulsy intenzity fluorescence jsou pozorovány v kanálu).
Umístěte 100 ul reakčních roztoků LLPS obsahujících 25 uM neznačeného monomerního Tau441 (s nebo bez 25 uM aS) do LLPS pufru (doplněného, ​​jak je uvedeno výše) na nevazbové 96-jamkové mikrodestičky s adhezivní fólií a tvorba kapiček byla zkontrolována pomocí WF mikroskopie po ekvilibrace.do 10 min.Po 48 hodinách inkubace při pokojové teplotě byla potvrzena přítomnost proteinových raftů a skvrn.Poté opatrně odstraňte kapalinu přes rafty z jamek, poté přidejte 50 1 disociačního pufru (10 mM HEPES, pH 7,4, 1 M NaCl, 1 mM DTT) a inkubujte 10 minut.Vysoká koncentrace soli zajišťuje, že se LLPS nebude opakovat kvůli reziduálnímu PEG a případné proteinové soubory vytvořené pouze elektrostatickými interakcemi budou rozebrány.Dno jamky bylo poté opatrně seškrábáno špičkou mikropipety a výsledný roztok byl přenesen do prázdné pozorovací jamky.Po inkubaci vzorků s 50 μM ThT po dobu 1 hodiny byla přítomnost izolovaných skvrn zkontrolována pomocí WF mikroskopie.Připravte sonikované aS fibrily inkubací 300 ul 70-uM roztoku aS v PBS s pH 7,4, azid sodný 0,01 % při 37 °C a 200 ot./min na orbitální třepačce po dobu 7 dnů.Roztok byl poté centrifugován při 9600 x g po dobu 30 minut, peleta byla resuspendována v PBS pH 7,4 a sonikována (1 min, 50% cyklus, 80% amplituda v sonikátoru Vibra-Cell VC130, Sonics, Newton, USA) vzorky fibril s relativně jednotnou distribucí velikosti malých fibril.
Analýza FCS/FCCS a detekce dvoubarevné koincidence (TCCD) byly provedeny na stejném fluorescenčním konfokálním mikroskopu MT200 s časovým rozlišením (Pico-Quant, Berlín, Německo), který byl použit pro mikroskopické experimenty FLIM-FRET s použitím režimu PIE.Výkon laseru pro tyto experimenty byl přidán na 6,0 uW (481 nm) a 6,2 uW (637 nm).Kombinace těchto výkonů laseru byla zvolena tak, aby produkovala podobnou jasnost pro páry použitých fluoroforů při dosažení optimálních četností a zabránění fotobělení a nasycení.Sběr dat i analýza byly provedeny pomocí komerčně dostupného softwaru SymphoTime64 verze 2.3 (PicoQuant, Berlín, Německo).
Vzorky izolovaných agregátů aS/Tau získaných pomocí LLPS se zředí v izolačním pufru na vhodnou monomolekulární koncentraci (typicky ředění 1:500, protože agregáty jsou již v nízkých koncentracích, když jsou izolovány z koacervátových vzorků).Vzorky byly aplikovány přímo na krycí sklíčka (Corning, USA) předem potažená roztokem BSA v koncentraci 1 mg/ml.
Pro analýzu PIE-smFRET v zelených a červených kanálech byl použit nižší práh intenzity 25 fotonů, aby se odfiltrovaly signály nízké intenzity způsobené monomerními jevy (všimněte si, že počet monomerů převyšuje agregované vzorky ve srovnání s izolovanými agregáty).Tento práh byl vypočítán jako pětinásobek průměrné intenzity monomerního aS získaného z analýzy vzorků čistého monomeru za účelem specifického výběru agregátů pro analýzu.Řídicí obvod PIE spolu se sběrem dat TSCPC umožnil použití celoživotního váhového filtru, který pomáhá eliminovat přeslechy pozadí a spektrální přeslechy.Intenzita vzplanutí vybraná pomocí výše uvedených prahových hodnot byla korigována pomocí průměrného signálu pozadí stanoveného z histogramů výskytu versus intenzita/bin vzorků obsahujících pouze pufr.Shluky spojené s velkými agregáty obvykle zabírají několik po sobě jdoucích zásobníků v časové stopě (nastaveno na 1 ms).V těchto případech byla zvolena popelnice s maximální pevností.Pro FRET a stechiometrickou analýzu byl použit teoreticky stanovený faktor gama γ (0,517).Příspěvky spektrálního přeslechu a přímé excitace jsou při použitém výkonu excitačního laseru zanedbatelné (určeno experimentálně).Účinnost a stechiometrie FRET při explozi se vypočítá následovně.