Chemická složka spirálových hadic z nerezové oceli 304, Struktura ektodomény SPACA6 obsahuje konzervovanou nadrodinu proteinů spojených s fúzí gamet.

Děkujeme, že jste navštívili Nature.com.Používáte verzi prohlížeče s omezenou podporou CSS.Chcete-li dosáhnout nejlepšího výsledku, doporučujeme použít aktualizovaný prohlížeč (nebo vypnout režim kompatibility v aplikaci Internet Explorer).Abychom zajistili trvalou podporu, zobrazujeme web bez stylů a JavaScriptu.
Posuvníky zobrazující tři články na snímku.Pro pohyb mezi snímky použijte tlačítka zpět a další, pro pohyb po jednotlivých snímcích použijte tlačítka posuvného ovladače na konci.

SPACA6 je povrchový protein exprimovaný spermiemi, který je kritický pro fúzi gamet během sexuální reprodukce savců.Navzdory této zásadní roli je specifická funkce SPACA6 špatně pochopena.Objasňujeme krystalovou strukturu extracelulární domény SPACA6 v rozlišení 2,2 Á, odhalujeme dvoudoménový protein složený ze čtyřvláknového svazku a Ig-podobných β-sendvičů spojených kvaziflexibilními linkery.Tato struktura se podobá IZUMO1, dalšímu proteinu asociovanému s fúzí gamet, díky čemuž jsou SPACA6 a IZUMO1 zakládajícími členy nadrodiny proteinů spojených s oplodněním, zde označovaných jako nadrodina IST.Nadrodina IST je strukturálně definována svým zkrouceným svazkem čtyř šroubovic a dvojicí disulfidicky spojených motivů CXXC.Strukturální vyhledávání AlphaFold lidského proteomu identifikovalo další proteinové členy této nadrodiny;pozoruhodně, mnoho z těchto proteinů se účastní fúze gamet.Struktura SPACA6 a její vztah k ostatním členům superrodiny IST poskytuje chybějící článek v našich znalostech o fúzi savčích gamet.
Každý lidský život začíná dvěma oddělenými haploidními gametami: otcovým spermatem a matčiným vajíčkem.Tato spermie je vítězem intenzivního selekčního procesu, během kterého miliony spermií procházejí ženským genitálním traktem, překonávají různé překážky1 a podstupují kapacitu, což zvyšuje jejich pohyblivost a proces povrchových komponent2,3,4.I když se spermie a oocyt najdou, proces ještě neskončil.Oocyt je obklopen vrstvou buněk cumulus a glykoproteinovou bariérou zvanou zona pellucida, kterou musí spermie projít, aby vstoupily do oocytu.Spermie využívají k překonání těchto konečných bariér kombinaci povrchových adhezních molekul a membránově asociovaných a sekretovaných enzymů5.Tyto molekuly a enzymy jsou uloženy hlavně ve vnitřní membráně a akrozomální matrici a jsou detekovány, když je vnější membrána spermie lyzována během akrozomální reakce6.Posledním krokem na této intenzivní cestě je fúze spermií a vajíček, při které obě buňky spojí své membrány, aby se staly jediným diploidním organismem7.I když je tento proces v lidské reprodukci přelomový, nezbytné molekulární interakce jsou špatně pochopeny.
Kromě oplodnění gamet byla rozsáhle studována chemie fúze dvou lipidových dvojvrstev.Obecně je membránová fúze energeticky nepříznivý proces, který vyžaduje, aby proteinový katalyzátor prošel strukturní konformační změnou, která přiblíží dvě membrány k sobě, naruší jejich kontinuitu a způsobí fúzi8,9.Tyto proteinové katalyzátory jsou známé jako fusogeny a byly nalezeny v bezpočtu fúzních systémů.Jsou nezbytné pro vstup viru do hostitelských buněk (např. gp160 u HIV-1, prudký nárůst u koronavirů, hemaglutinin u virů chřipky)10,11,12 placentární (syncytin)13,14,15 a fúze tvořící gamety v nižších eukaryotech ( HAP2/GCS1 u rostlin, protistů a členovců) 16,17,18,19.Fusogeny pro lidské gamety ještě nebyly objeveny, ačkoli se ukázalo, že několik proteinů je kritických pro připojení a fúzi gamet.CD9 exprimovaný oocyty, transmembránový protein potřebný pro fúzi myších a lidských gamet, byl první objevený 21,22,23.Ačkoli jeho přesná funkce zůstává nejasná, zdá se pravděpodobná role v adhezi, struktura adhezních ložisek na vaječných mikroklcích a/nebo správná lokalizace povrchových proteinů oocytů 24,25,26.Dva nejtypičtější proteiny, které jsou kritické pro fúzi gamet, jsou sperma protein IZUMO127 a oocytární protein JUNO28 a jejich vzájemná asociace je důležitým krokem v rozpoznání a adhezi gamet před fúzí.Samci Izumo1 knockout myší a samice Juno knockout myší jsou zcela sterilní, v těchto modelech spermie vstupují do perivitelinního prostoru, ale gamety se neslučují.Podobně se konfluence snížila, když byly gamety ošetřeny protilátkami anti-IZUMO1 nebo JUNO27,29 v experimentech s lidským oplodněním in vitro.
Nedávno byla objevena nově objevená skupina proteinů exprimovaných ve spermiích fenotypově podobných IZUMO1 a JUNO20,30,31,32,33,34,35.Protein 6 spojený s akrozomální membránou spermií (SPACA6) byl identifikován jako nezbytný pro oplodnění ve velké studii mutageneze u myší.Inzerce transgenu do genu Spaca6 produkuje nefúzní spermie, ačkoli tato spermie infiltrují perivitelinní prostor36.Následné knockout studie u myší potvrdily, že Spaca6 je nutný pro fúzi gamet30,32.SPACA6 je exprimován téměř výhradně ve varlatech a má podobný lokalizační vzorec jako IZUMO1, konkrétně uvnitř intimy spermií před akrozomální reakcí a poté migruje do ekvatoriální oblasti po akrozomální reakci 30,32.Homology Spaca6 existují u různých savců a dalších eukaryot30 a jeho význam pro fúzi lidských gamet byl prokázán inhibicí lidské fertilizace in vitro rezistencí vůči SPACA630.Na rozdíl od IZUMO1 a JUNO zůstávají detaily struktury, interakcí a funkce SPACA6 nejasné.
Abychom lépe porozuměli základnímu procesu, který je základem fúze lidských spermií a vajíček, což nám umožní informovat o budoucím vývoji v plánování rodičovství a léčbě neplodnosti, provedli jsme strukturální a biochemické studie SPACA6.Krystalová struktura extracelulární domény SPACA6 ukazuje čtyřšroubovicový svazek (4HB) a doménu podobnou imunoglobulinu (podobnou Ig) spojené kvaziflexibilními oblastmi.Jak bylo předpovězeno v předchozích studiích,7,32,37 doménová struktura SPACA6 je podobná struktuře lidského IZUMO1 a tyto dva proteiny sdílejí neobvyklý motiv: 4HB s trojúhelníkovým helikálním povrchem a párem disulfidicky spojených motivů CXXC.Navrhujeme, aby IZUMO1 a SPACA6 nyní definovaly větší, strukturně příbuznou superrodinu proteinů spojených s fúzí gamet.Pomocí funkcí jedinečných pro tuto superrodinu jsme provedli vyčerpávající pátrání po strukturálním lidském proteomu AlphaFold a identifikovali další členy této superrodiny, včetně několika členů zapojených do fúze a/nebo oplodnění gamet.Nyní se zdá, že existuje společný strukturní záhyb a nadrodina proteinů spojených s fúzí gamet a naše struktura poskytuje molekulární mapu tohoto důležitého aspektu mechanismu fúze lidských gamet.
SPACA6 je jednoprůchodový transmembránový protein s jedním N-vázaným glykanem a šesti předpokládanými disulfidovými vazbami (obrázky S1a a S2).Vyjádřili jsme extracelulární doménu lidského SPACA6 (zbytky 27–246) v buňkách Drosophila S2 a vyčistili protein pomocí afinity niklu, výměny kationtů a chromatografie s vylučováním podle velikosti (obr. S1b).Purifikovaná ektodoména SPACA6 je velmi stabilní a homogenní.Analýza pomocí vylučovací chromatografie v kombinaci s polygonálním rozptylem světla (SEC-MALS) odhalila jeden pík s vypočtenou molekulovou hmotností 26,2 ± 0,5 kDa (obr. S1c).To je v souladu s velikostí monomerní ektodomény SPACA6, což ukazuje, že během čištění nedošlo k oligomerizaci.Spektroskopie cirkulárního dichroismu (CD) navíc odhalila smíšenou strukturu α/β s bodem tání 51,3 °C (obr. S1d,e).Dekonvoluce CD spekter odhalila 38,6 % α-helikálních a 15,8 % β-vláknových prvků (obrázek S1d).
Ektodoména SPACA6 byla krystalizována pomocí náhodného naočkování matrice38, což vedlo k souboru dat s rozlišením 2,2 Á (tabulka 1 a obrázek S3).S použitím kombinace molekulární substituce založené na fragmentech a dat z fázování SAD s expozicí bromidu pro stanovení struktury (tabulka 1 a obrázek S4) se konečný rafinovaný model skládá ze zbytků 27–246.V době, kdy byla struktura určena, nebyly k dispozici žádné experimentální nebo AlphaFold struktury.Ektodoména SPACA6 měří 20 Å × 20 Å × 85 Å, skládá se ze sedmi šroubovic a devíti β-řetězců a má prodloužený terciární záhyb stabilizovaný šesti disulfidovými vazbami (obr. 1a, b).Slabá elektronová hustota na konci postranního řetězce Asn243 ukazuje, že tento zbytek je N-vázaná glykosylace.Struktura se skládá ze dvou domén: N-koncový svazek čtyř šroubovic (4HB) a C-koncová doména podobná Ig se střední pantovou oblastí mezi nimi (obr. 1c).
a Struktura extracelulární domény SPACA6.Proužkový diagram extracelulární domény SPACA6, barva řetězce od N k C-konci od tmavě modré po tmavě červenou.Cysteiny zapojené do disulfidových vazeb jsou zvýrazněny purpurově.b Topologie extracelulární domény SPACA6.Použijte stejné barevné schéma jako na obrázku 1a.c SPACA6 extracelulární doména.4HB, pant a Ig-like domain strip charts jsou zbarveny oranžově, zeleně a modře.Vrstvy nejsou nakresleny v měřítku.
Doména 4HB SPACA6 zahrnuje čtyři hlavní helixy (helixy 1–4), které jsou uspořádány ve formě helikální šroubovice (obr. 2a), střídající se mezi antiparalelními a paralelními interakcemi (obr. 2b).Malá přídavná jednootáčková šroubovice (šroubovice 1′) je položena kolmo na svazek, tvořící trojúhelník se šroubovicemi 1 a 2. Tento trojúhelník je mírně deformován ve šroubovici zkrouceném obalu relativně hustého obalu šroubovice 3 a 4 ( Obr. 2a).
4HB N-terminální páskový graf.b Pohled shora na svazek čtyř šroubovic, každá šroubovice je na N-konci zvýrazněna tmavě modře a na C-konci tmavě červeně.c Schéma spirálového kola shora dolů pro 4HB, přičemž každý zbytek je zobrazen jako kruh označený jednopísmenným kódem aminokyseliny;pouze čtyři aminokyseliny v horní části kola jsou očíslovány.Nepolární zbytky jsou zbarveny žlutě, polární nenabité zbytky jsou zbarveny zeleně, kladně nabité zbytky jsou zbarveny modře a záporně nabité zbytky jsou zbarveny červeně.d Trojúhelníkové plochy domény 4HB se 4HB v oranžové barvě a panty v zelené barvě.Obě vložky vykazují tyčinkovité disulfidové vazby.
4HB je koncentrován na vnitřním hydrofobním jádru složeném převážně z alifatických a aromatických zbytků (obr. 2c).Jádro obsahuje disulfidovou vazbu mezi Cys41 a Cys55, která spojuje šroubovice 1 a 2 dohromady v horním vyvýšeném trojúhelníku (obr. 2d).Dvě další disulfidové vazby byly vytvořeny mezi motivem CXXC v Helix 1' a dalším motivem CXXC nalezeným na špičce β-vlásenky v oblasti pantu (obr. 2d).Konzervativní argininový zbytek s neznámou funkcí (Arg37) se nachází uvnitř dutého trojúhelníku tvořeného šroubovicemi 1′, 1 a 2. Alifatické atomy uhlíku Cβ, Cγ a Cδ Arg37 interagují s hydrofobním jádrem a jeho guanidinové skupiny se cyklicky pohybují mezi šroubovicemi 1 'a 1 prostřednictvím interakcí mezi Thr32 páteří a postranním řetězcem (obr. S5a,b).Tyr34 zasahuje do dutiny a zanechává dvě malé dutiny, kterými může Arg37 interagovat s rozpouštědlem.
Ig-like β-sendvičové domény jsou velkou nadrodinou proteinů, které sdílejí společný rys dvou nebo více vícevláknových amfipatických β-listů interagujících prostřednictvím hydrofobního jádra 39. C-terminální Ig-like doména SPACA6 má stejný vzor a skládá se ze dvou vrstev (obr. S6a).List 1 je β-list čtyř vláken (vlákna D, F, H a I), kde vlákna F, H a I tvoří antiparalelní uspořádání a vlákna I a D mají paralelní interakci.Tabulka 2 je malý antiparalelní dvouvláknový beta list (vlákna E a G).Vnitřní disulfidová vazba byla pozorována mezi C-koncem řetězce E a středem řetězce H (Cys170-Cys226) (obr. S6b).Tato disulfidová vazba je analogická disulfidové vazbě v β-sendvičové doméně imunoglobulinu40,41.
Čtyřvláknový β-list se kroutí po celé své délce a tvoří asymetrické okraje, které se liší tvarem a elektrostatikou.Tenčí okraj je plochý hydrofobní povrch prostředí, který vyniká ve srovnání se zbývajícími nerovnými a elektrostaticky odlišnými povrchy v SPACA6 (obr. S6b,c).Halo exponovaných karbonylových/aminoskupin a polárních postranních řetězců obklopuje hydrofobní povrch (obr. S6c).Širší okraj je pokryt zavíčkovaným spirálovitým segmentem, který blokuje N-terminální část hydrofobního jádra a tvoří tři vodíkové vazby s otevřenou polární skupinou páteře F řetězce (obr. S6d).C-koncová část tohoto okraje tvoří velkou kapsu s částečně odkrytým hydrofobním jádrem.Kapsa je obklopena kladnými náboji v důsledku tří sad dvojitých argininových zbytků (Arg162-Arg221, Arg201-Arg205 a Arg212-Arg214) a centrálního histidinu (His220) (obrázek S6e).
Pantová oblast je krátký segment mezi helikální doménou a doménou podobnou Ig, sestávající z jedné antiparalelní třívláknové β-vrstvy (vlákna A, B a C), malé 310 šroubovice a několika dlouhých náhodných helikálních segmentů.(obr. S7).Zdá se, že síť kovalentních a elektrostatických kontaktů v pantové oblasti stabilizuje orientaci mezi 4HB a doménou podobnou Ig.Síť lze rozdělit na tři části.První část obsahuje dva motivy CXXC (27CXXC30 a 139CXXC142), které tvoří pár disulfidových vazeb mezi β-vlásenkou v pantu a 1′ šroubovicí v 4HB.Druhá část zahrnuje elektrostatické interakce mezi doménou podobnou Ig a pantem.Glu132 v pantu tvoří solný můstek s Arg233 v Ig-like doméně a Arg135 v pantu.Třetí část obsahuje kovalentní vazbu mezi doménou podobnou Ig a pantovou oblastí.Dvě disulfidové vazby (Cys124-Cys147 a Cys128-Cys153) spojují pantovou smyčku s linkerem, který je stabilizován elektrostatickými interakcemi mezi Gln131 a funkční skupinou páteře, což umožňuje přístup k první Ig-like doméně.řetěz.
Struktura ektodomény SPACA6 a jednotlivé struktury 4HB a Ig-like domén byly použity k hledání strukturně podobných záznamů v proteinových databázích 42 .Identifikovali jsme shodu s vysokým skóre Dali Z, malými standardními odchylkami a velkými skóre LALI (poslední je počet strukturně ekvivalentních zbytků).Zatímco prvních 10 zásahů z úplného vyhledávání ektodomény (tabulka S1) mělo přijatelné Z-skóre >842, samotné hledání 4HB nebo domény podobné Ig ukázalo, že většina těchto zásahů odpovídala pouze β-sendvicům.všudypřítomný záhyb nalezený v mnoha proteinech.Všechna tři hledání v Dali vrátila pouze jeden výsledek: IZUMO1.
Již dlouho se předpokládá, že SPACA6 a IZUMO1 sdílejí strukturální podobnosti7,32,37.Ačkoli ektodomény těchto dvou proteinů spojených s fúzí gamet sdílejí pouze 21% sekvenční identitu (obrázek S8a), komplexní důkazy, včetně vzoru konzervovaných disulfidových vazeb a předpokládané C-terminální domény podobné Ig v SPACA6, umožnily rané pokusy vybudovat homologní model myši A a SPACA6 s použitím IZUMO1 jako templátu37.Naše struktura potvrzuje tyto předpovědi a ukazuje skutečnou míru podobnosti.Ve skutečnosti struktury SPACA6 a IZUMO137,43,44 sdílejí stejnou dvoudoménovou architekturu (obr. S8b) s podobnými 4HB a Ig-podobnými β-sendvičovými doménami spojenými pantovou oblastí (obr. S8c).
IZUMO1 a SPACA6 4HB mají společné rozdíly od konvenčních spirálových svazků.Typické 4HB, jako ty, které se nacházejí v proteinových komplexech SNARE zapojených do endozomální fúze 45, 46, mají rovnoměrně rozmístěné šroubovice udržující konstantní zakřivení kolem centrální osy 47. Naproti tomu spirálové domény v IZUMO1 i SPACA6 byly zkreslené s proměnným zakřivením a nerovnoměrné balení (obrázek S8d).Zkroucení, pravděpodobně způsobené trojúhelníkem tvořeným šroubovicemi 1′, 1 a 2, je zachováno v IZUMO1 a SPACA6 a stabilizováno stejným motivem CXXC na šroubovici 1′.Nicméně další disulfidová vazba nalezená ve SPACA6 (Cys41 a Cys55 kovalentně spojující šroubovice 1 a 2 výše) vytváří ostřejší vrchol na vrcholu trojúhelníku, díky čemuž je SPACA6 více zkroucený než IZUMO1, s výraznějšími dutinovými trojúhelníky.Kromě toho IZUMO1 postrádá Arg37 pozorovaný ve středu této dutiny v SPACA6.Naproti tomu IZUMO1 má typičtější hydrofobní jádro z alifatických a aromatických zbytků.
IZUMO1 má doménu podobnou Ig sestávající z dvouvláknového a pětivláknového β-listu43.Další vlákno v IZUMO1 nahrazuje cívku ve SPACA6, která interaguje s vláknem F, aby omezila vodíkové vazby páteře ve vláknu.Zajímavým bodem srovnání je předpokládaný povrchový náboj Ig-podobných domén těchto dvou proteinů.Povrch IZUMO1 je negativněji nabitý než povrch SPACA6.Další náboj je umístěn poblíž C-konce směrem k membráně spermií.Ve SPACA6 byly stejné oblasti neutrálnější nebo kladně nabité (obr. S8e).Například hydrofobní povrch (tenčí okraje) a kladně nabité důlky (širší okraje) v SPACA6 jsou v IZUMO1 záporně nabité.
Ačkoli vztah a sekundární struktura prvky mezi IZUMO1 a SPACA6 jsou dobře zachovány, strukturální zarovnání Ig-jako domény ukázaly, že dvě domény se liší ve své obecné orientaci vůči sobě navzájem (obr. S9).Spirálový svazek IZUMO1 je zakřiven kolem β-sendviče a vytváří dříve popsaný tvar „bumerangu“ asi 50° od středové osy.Naproti tomu spirálový paprsek ve SPACA6 byl nakloněn asi o 10° v opačném směru.Rozdíly v těchto orientacích jsou pravděpodobně způsobeny rozdíly v oblasti závěsu.Na úrovni primární sekvence sdílejí IZUMO1 a SPACA6 malou sekvenční podobnost na pantu, s výjimkou zbytků cysteinu, glycinu a kyseliny asparagové.V důsledku toho jsou vodíkové vazby a elektrostatické sítě zcela odlišné.Prvky sekundární struktury β-listu jsou sdíleny IZUMO1 a SPACA6, ačkoli řetězce v IZUMO1 jsou mnohem delší a šroubovice 310 (helix 5) je jedinečná pro SPACA6.Tyto rozdíly mají za následek různé orientace domén pro dva jinak podobné proteiny.
Naše vyhledávání na serveru Dali odhalilo, že SPACA6 a IZUMO1 jsou jediné dvě experimentálně určené struktury uložené v proteinové databázi, které mají tento konkrétní 4HB fold (tabulka S1).Nedávno společnost DeepMind (Alphabet/Google) vyvinula AlphaFold, systém založený na neuronové síti, který dokáže přesně předpovídat 3D struktury proteinů z primárních sekvencí48.Krátce poté, co jsme vyřešili strukturu SPACA6, byla uvolněna databáze AlphaFold, která poskytuje modely prediktivní struktury pokrývající 98,5 % všech proteinů v lidském proteomu48,49.Pomocí naší vyřešené struktury SPACA6 jako vyhledávacího modelu identifikovalo hledání strukturní homologie pro model v lidském proteomu AlphaFold kandidáty s možnými strukturálními podobnostmi s SPACA6 a IZUMO1.Vzhledem k neuvěřitelné přesnosti AlphaFold při předpovídání SPACA6 (obr. S10a) – zejména ektodomény 1,1 Å rms ve srovnání s naší vyřešenou strukturou (obr. S10b) – si můžeme být jisti, že identifikované shody SPACA6 budou pravděpodobně přesné.
Dříve PSI-BLAST hledal klastr IZUMO1 se třemi dalšími proteiny asociovanými se spermiemi: IZUMO2, IZUMO3 a IZUMO450.AlphaFold předpověděl, že tyto proteiny rodiny IZUMO se skládají do domény 4HB se stejným vzorem disulfidových vazeb jako IZUMO1 (obrázky 3a a S11), ačkoli jim chybí doména podobná Ig.Předpokládá se, že IZUMO2 a IZUMO3 jsou jednostranné membránové proteiny podobné IZUMO1, zatímco IZUMO4 se zdá být vylučován.Funkce proteinů IZUMO 2, 3 a 4 ve fúzi gamet nebyly stanoveny.Je známo, že IZUMO3 hraje roli v biogenezi akrozomů během vývoje spermií51 a bylo zjištěno, že protein IZUMO tvoří komplex50.Konzervace proteinů IZUMO u savců, plazů a obojživelníků naznačuje, že jejich potenciální funkce je konzistentní s funkcí jiných známých proteinů spojených s fúzí gamet, jako jsou DCST1/2, SOF1 a FIMP.
Diagram architektury domény nadrodiny IST s 4HB, pantem a doménami podobnými Ig zvýrazněnými oranžově, zeleně a modře.IZUMO4 má jedinečnou oblast C-konce, která vypadá černě.Potvrzené a domnělé disulfidové vazby jsou znázorněny plnými a tečkovanými čarami.b IZUMO1 (PDB: 5F4E), SPACA6, IZUMO2 (AlphaFold DB: AF-Q6UXV1-F1), IZUMO3 (AlphaFold DB: AF-Q5VZ72-F1), IZUMO4 (AlphaFold DB: AF-Q1ZYL8-F1) a AlphaTMEMold DB: AF-Q1ZYL8-F1) : AF-Q1ZYL8-F1) : AF-Q3KNT9-F1) jsou zobrazeny ve stejném barevném rozsahu jako panel A. Disulfidové vazby jsou zobrazeny purpurově.Transmembránové šroubovice TMEM95, IZUMO2 a IZUMO3 nejsou zobrazeny.
Na rozdíl od proteinu IZUMO jsou jiné proteiny SPACA (tj. SPACA1, SPACA3, SPACA4, SPACA5 a SPACA9) považovány za strukturálně odlišné od SPACA6 (obr. S12).Pouze SPACA9 má 4HB, ale neočekává se, že bude mít stejnou paralelní-antiparalelní orientaci nebo stejnou disulfidovou vazbu jako SPACA6.Pouze SPACA1 má podobnou doménu podobnou Ig.AlphaFold předpovídá, že SPACA3, SPACA4 a SPACA5 mají úplně jinou strukturu než SPACA6.Je zajímavé, že SPACA4 je také známo, že hraje roli při oplodnění, ale ve větší míře než SPACA6, místo toho usnadňuje interakci mezi spermiemi a oocyty zona pellucida52.
Naše vyhledávání AlphaFold našlo další shodu pro IZUMO1 a SPACA6 4HB, TMEM95.TMEM95, jediný transmembránový protein specifický pro spermie, způsobuje, že samci myší jsou po ablaci neplodní 32,33.Spermie postrádající TMEM95 měly normální morfologii, pohyblivost a schopnost pronikat do zona pellucida a vázat se na membránu vajíčka, ale nemohly fúzovat s membránou oocytů.Předchozí studie ukázaly, že TMEM95 sdílí strukturální podobnosti s IZUMO133.Model AlphaFold skutečně potvrdil, že TMEM95 je 4HB se stejným párem motivů CXXC jako IZUMO1 a SPACA6 a stejnou další disulfidovou vazbou mezi šroubovicemi 1 a 2, která se nachází v SPACA6 (obr. 3a a S11).Ačkoli TMEM95 postrádá doménu podobnou Ig, má oblast se vzorem disulfidové vazby podobnou pantovým oblastem SPACA6 a IZUMO1 (obr. 3b).V době zveřejnění tohoto rukopisu předtiskový server hlásil strukturu TMEM95 a potvrdil výsledek AlphaFold53.TMEM95 je velmi podobný SPACA6 a IZUMO1 a je evolučně konzervován již u obojživelníků (obr. 4 a S13).
Vyhledávání PSI-BLAST použilo databáze NCBI SPACA6, IZUMO1-4, TMEM95, DCST1, DCST2, FIMP a SOF1 k určení pozice těchto sekvencí ve stromu života.Vzdálenosti mezi body větvení nejsou zobrazeny v měřítku.
Nápadná celková strukturální podobnost mezi SPACA6 a IZUMO1 naznačuje, že jsou zakládajícími členy konzervované strukturální nadrodiny, která zahrnuje proteiny TMEM95 a IZUMO 2, 3 a 4.známí členové: IZUMO1, SPACA6 a TMEM95.Protože pouze několik členů má domény podobné Ig, charakteristickým znakem nadrodiny IST je doména 4HB, která má jedinečné vlastnosti společné všem těmto proteinům: 1) Svinutý 4HB se šroubovicemi uspořádanými v antiparalelní/paralelní alternaci (obr. . 5a), 2) svazek má trojúhelníkovou plochu sestávající ze dvou šroubovic ve svazku a třetí vertikální šroubovice (obrázek klíčová oblast obr. 5c). Je známo, že motiv CXXC, nalezený v proteinech podobných thioredoxinu, funguje jako redoxní senzor54,55,56, zatímco motiv u členů rodiny IST může být asociován s proteinovými disulfidovými izomerázami, jako je ERp57 ve fúzi gamet.Role jsou asociovány 57,58.
Členové nadrodiny IST jsou definováni třemi charakteristickými rysy domény 4HB: čtyřmi šroubovicemi střídajícími se mezi paralelní a antiparalelní orientací, ba-trojúhelníkovým helikálním svazkem a dvojitým motivem ca CXXC vytvořeným mezi malými molekulami.) N-terminální šroubovice (oranžová) a pantová oblast β-vlásenka (zelená).
Vzhledem k podobnosti mezi SPACA6 a IZUMO1 byla testována schopnost prvního vázat se na IZUMO1 nebo JUNO.Biolayer interferometrie (BLI) je kinetická vazebná metoda, která se dříve používala ke kvantifikaci interakce mezi IZUMO1 a JUNO.Po inkubaci biotinem značeného senzoru s IZUMO1 jako návnadou s vysokou koncentrací analytu JUNO byl detekován silný signál (obr. S14a), který ukazuje na vazbou indukovanou změnu tloušťky biomateriálu připojeného ke špičce senzoru.Podobné signály (tj. JUNO spojený se senzorem jako návnada proti analytu IZUMO1) (obr. S14b).Nebyl detekován žádný signál, když byl SPACA6 použit jako analyt proti IZUMO1 vázanému na senzor nebo JUNO vázanému na senzor (obrázek S14a,b).Absence tohoto signálu ukazuje, že extracelulární doména SPACA6 neinteraguje s extracelulární doménou IZUMO1 nebo JUNO.
Protože je test BLI založen na biotinylaci volných lysinových zbytků na návnadovém proteinu, může tato modifikace zabránit vazbě, pokud jsou do interakce zapojeny lysinové zbytky.Kromě toho může orientace vazby vzhledem k senzoru vytvářet sterické překážky, takže konvenční pull-down testy byly také prováděny na rekombinantních ektodoménách SPACA6, IZUMO1 a JUNO.Navzdory tomu se SPACA6 nevysrážela s His-značeným IZUMO1 nebo His-značeným JUNO (obr. S14c,d), což ukazuje na žádnou interakci konzistentní s interakcí pozorovanou v experimentech BLI.Jako pozitivní kontrola jsme potvrdili interakci JUNO se značeným His IZUMO1 (obrázky S14e a S15).
Navzdory strukturální podobnosti mezi SPACA6 a IZUMO1 není neschopnost SPACA6 vázat JUNO překvapivá.Povrch lidského IZUMO1 má více než 20 zbytků, které interagují s JUNO, včetně zbytků z každé ze tří oblastí (ačkoli většina z nich se nachází v pantové oblasti) (obr. S14f).Z těchto zbytků je pouze jeden konzervován ve SPACA6 (Glu70).Zatímco mnoho substitucí zbytků si zachovalo své původní biochemické vlastnosti, esenciální Arg160 zbytek v IZUMO1 byl nahrazen záporně nabitým Asp148 v SPACA6;předchozí studie ukázaly, že mutace Arg160Glu v IZUMO1 téměř úplně ruší vazbu na JUNO43.Kromě toho rozdíl v orientaci domény mezi IZUMO1 a SPACA6 významně zvýšil povrch JUNO-vazebného místa ekvivalentní oblasti na SPACA6 (obr. S14g).
Navzdory známé potřebě SPACA6 pro fúzi gamet a její podobnosti s IZUMO1 se nezdá, že SPACA6 má ekvivalentní vazebnou funkci JUNO.Proto jsme se snažili spojit naše strukturální data s důkazy důležitosti, které poskytuje evoluční biologie.Porovnání sekvencí homologů SPACA6 ukazuje zachování společné struktury mimo savce.Například cysteinové zbytky jsou přítomny i u vzdáleně příbuzných obojživelníků (obr. 6a).Pomocí serveru ConSurf byla na povrch SPACA6 mapována retenční data vícenásobného zarovnání sekvencí 66 sekvencí.Tento typ analýzy může ukázat, které zbytky byly zachovány během evoluce proteinu, a může ukázat, které povrchové oblasti hrají roli ve funkci.
a Zarovnání sekvencí ektodomén SPACA6 z 12 různých druhů připravených pomocí CLUSTAL OMEGA.Podle analýzy ConSurf jsou nejkonzervativnější pozice označeny modře.Zbytky cysteinu jsou zvýrazněny červeně.Hranice domén a prvky sekundární struktury jsou zobrazeny v horní části zarovnání, kde šipky označují β-vlákna a vlny označují šroubovice.Přístupové identifikátory NCBI obsahující sekvence jsou: člověk (Homo sapiens, NP_001303901), mandril (Mandrilus leucophaeus, XP_011821277), kapucínská opice (Cebus napodobenina, XP_017359366), kůň (Equus khale2505), kůň (Equus khale25 3_23 XP_032_034) .), ovce (Ovis aries, XP_014955560), slon (Loxodonta africana, XP_010585293), pes (Canis lupus familyis, XP_025277208), myš (Mus musculus, NP_001156381), XP_03618 ďábel, XP_03611 ďábel ), ptakopysk, 8) , 61_89 a Bullfrog (Bufo bufo, XP_040282113).Číslování je založeno na lidském řádu.b Povrchová reprezentace struktury SPACA6 se 4HB nahoře a doménou podobnou Ig dole, barvy založené na odhadech zachování ze serveru ConSurf.Nejzachovalejší části jsou modré, středně zachovalé části bílé a nejméně zachovalé žluté.purpurový cystein.Tři povrchové záplaty prokazující vysokou úroveň ochrany jsou zobrazeny na vložce označené záplaty 1, 2 a 3. V pravé horní části je zobrazen karikatura 4HB (stejné barevné schéma).
Struktura SPACA6 má tři vysoce konzervované povrchové oblasti (obr. 6b).Patch 1 zahrnuje 4HB a pantovou oblast a obsahuje dva konzervované CXXC disulfidové můstky, pantovou síť Arg233-Glu132-Arg135-Ser144 (obr. S7) a tři konzervované vnější aromatické zbytky (Phe31, Tyr73, Phe137)).širší okraj Ig-like domény (obr. S6e), který představuje několik kladně nabitých zbytků na povrchu spermií.Je zajímavé, že tato náplast obsahuje protilátkový epitop, u kterého bylo dříve prokázáno, že interferuje s funkcí SPACA6 30.Oblast 3 překlenuje pant a jednu stranu Ig-podobné domény;tato oblast obsahuje konzervované proliny (Pro126, Pro127, Pro150, Pro154) a směrem ven směřující polární/nabité zbytky.Překvapivě je většina zbytků na povrchu 4HB vysoce variabilní (obr. 6b), ačkoli skládání je konzervováno v celém homologu SPACA6 (jak naznačuje konzervatismus jádra hydrofobního svazku) i mimo nadrodinu IST.
Ačkoli se jedná o nejmenší oblast ve SPACA6 s nejmenším počtem detekovatelných prvků sekundární struktury, mnoho zbytků pantové oblasti (včetně oblasti 3) je mezi homology SPACA6 vysoce konzervováno, což může naznačovat, že orientace spirálového svazku a β-sendviče hraje roli.jako konzervativce.Navzdory rozsáhlým vodíkovým můstkům a elektrostatickým sítím v pantové oblasti SPACA6 a IZUMO1 je však možné vidět důkaz vnitřní flexibility v zarovnání více povolených struktur IZUMO137,43,44.Zarovnání jednotlivých domén se dobře překrývaly, ale orientace domén vůči sobě se lišila od 50° do 70° od centrální osy (obr. S16).Pro pochopení konformační dynamiky SPACA6 v roztoku byly provedeny experimenty SAXS (obr. S17a,b).Ab initio rekonstrukce ektodomény SPACA6 odpovídala tyčové krystalové struktuře (obr. S18), i když Kratkyho graf vykazoval určitou míru flexibility (obr. S17b).Tato konformace kontrastuje s IZUMO1, ve kterém nenavázaný protein nabývá tvaru bumerangu jak v mřížce, tak v roztoku43.
Pro specifickou identifikaci flexibilní oblasti byla provedena hmotnostní spektroskopie výměny vodíku a deuteria (H-DXMS) na SPACA6 a porovnána s údaji dříve získanými na IZUMO143 (obr. 7a,b).SPACA6 je zřetelně flexibilnější než IZUMO1, o čemž svědčí vyšší výměna deuteria v celé struktuře po 100 000 s výměny.V obou strukturách vykazuje C-terminální část pantové oblasti vysokou úroveň výměny, což pravděpodobně umožňuje omezenou rotaci 4HB a domén podobných Ig vůči sobě navzájem.Je zajímavé, že C-terminální část pantu SPACA6, sestávající ze zbytku 147CDLPLDCP154, je vysoce konzervovaná oblast 3 (obr. 6b), což možná ukazuje, že mezidoménová flexibilita je evolučně konzervovanou vlastností SPACA6.Podle analýzy pružnosti data tepelného tání CD ukázala, že SPACA6 (Tm = 51,2 °C) je méně stabilní než IZUMO1 (Tm = 62,9 °C) (obr. S1e a S19).
a H-DXMS obrázky SPACA6 a b IZUMO1.Procentuální výměna deuteria byla stanovena v uvedených časových bodech.Úrovně výměny vodík-deuterium jsou označeny barvou na stupnici od modré (10 %) do červené (90 %).Černé skříňky představují oblasti s vysokou výměnou.Hranice 4HB, pantu a domény podobné Ig pozorované v krystalové struktuře jsou ukázány nad primární sekvencí.Úrovně výměny deuteria při 10 s, 1 000 s a 100 000 s byly vyneseny do pruhového grafu superponovaného na průhledné molekulární povrchy SPACA6 a IZUMO1.Části struktur s úrovní výměny deuteria pod 50 % jsou zbarveny bíle.Oblasti nad 50% výměnou H-DXMS jsou vybarveny v gradientní škále.
Použití CRISPR/Cas9 a genetických strategií knockout myšího genu vedlo k identifikaci několika faktorů důležitých pro vazbu a fúzi spermií a vajíček.Kromě dobře charakterizované interakce IZUMO1-JUNO a struktury CD9 zůstává většina proteinů spojených s fúzí gamet strukturně a funkčně záhadná.Biofyzikální a strukturní charakterizace SPACA6 je dalším kouskem molekulární skládačky adheze/fúze během oplodnění.
Zdá se, že SPACA6 a další členové nadrodiny IST jsou vysoce konzervativní u savců, stejně jako u jednotlivých ptáků, plazů a obojživelníků;ve skutečnosti se má za to, že SPACA6 je dokonce vyžadován pro oplodnění u zebřiček 59. Tato distribuce je podobná jiným známým proteinům spojeným s fúzí gamet, jako jsou DCST134, DCST234, FIMP31 a SOF132, což naznačuje, že tyto faktory jsou deficitní HAP2 (také známé jako GCS1) proteiny, které jsou zodpovědné za katalytickou aktivitu mnoha protistů., rostliny a členovci.Oplodněné fúzní proteiny 60, 61. Navzdory silné strukturální podobnosti mezi SPACA6 a IZUMO1 mělo vyřazení genů kódujících kterýkoli z těchto proteinů za následek neplodnost u samců myší, což naznačuje, že jejich funkce ve fúzi gamet nejsou duplikovány..Obecněji řečeno, žádný ze známých proteinů spermií potřebných pro adhezní fázi fúze není nadbytečný.
Zůstává otevřenou otázkou, zda se SPACA6 (a další členové superrodiny IST) účastní intergametických spojení, vytvářejí intragametické sítě pro rekrutování důležitých proteinů do fúzních bodů, nebo snad dokonce působí jako nepolapitelné fuzogeny.Koimunoprecipitační studie na buňkách HEK293T odhalily interakci mezi IZUMO1 plné délky a SPACA632.Naše rekombinantní ektodomény však in vitro neinteragovaly, což naznačuje, že interakce pozorované v Noda et al.byly oba v konstruktu odstraněny (všimněte si cytoplazmatického ocasu IZUMO1, který se ukázal jako nepotřebný pro oplodnění62).Alternativně mohou IZUMO1 a/nebo SPACA6 vyžadovat specifická vazebná prostředí, která nereprodukujeme in vitro, jako jsou fyziologicky specifické konformace nebo molekulární komplexy obsahující jiné proteiny (známé nebo dosud neobjevené).Ačkoli se předpokládá, že ektodoména IZUMO1 zprostředkovává připojení spermií k vajíčku v perivitelinním prostoru, účel ektodomény SPACA6 není jasný.
Struktura SPACA6 odhaluje několik konzervovaných povrchů, které se mohou podílet na interakcích protein-protein.Konzervovaná část pantové oblasti bezprostředně sousedící s motivem CXXC (označená výše Patch 1) má několik směrem ven směřujících aromatických zbytků, které jsou často spojeny s hydrofobními a π-skládacími interakcemi mezi biomolekulami.Široké strany Ig-podobné domény (oblast 2) tvoří kladně nabitou drážku s vysoce konzervovanými zbytky Arg a His a protilátky proti této oblasti byly dříve použity k blokování fúze gamet30.Protilátka rozpoznává lineární epitop 212RIRPAQLTHRGTFS225, který má tři ze šesti argininových zbytků a vysoce konzervovaný His220.Není jasné, zda je dysfunkce způsobena zablokováním těchto specifických zbytků nebo celé oblasti.Umístění této mezery blízko C-konce β-sendviče ukazuje na cis-interakce se sousedními proteiny spermie, ale ne s proteiny oocytů.Kromě toho retence vysoce flexibilního spleti bohatého na prolin (místo 3) v pantu může být místem interakce protein-protein nebo pravděpodobněji ukazuje zachování flexibility mezi těmito dvěma doménami.Pro neznámou roli SPACA6 je důležité pohlaví.fúze gamet.
SPACA6 má vlastnosti mezibuněčných adhezních proteinů, včetně Ig-like β-sendvičů.Mnoho adhezivních proteinů (např. kadheriny, integriny, adheziny a IZUMO1) má jednu nebo více β-sendvičových domén, které rozšiřují proteiny z buněčné membrány k jejich environmentálním cílům63,64,65.Ig-like doména SPACA6 také obsahuje motiv běžně se vyskytující v β-sendvicích adheze a koheze: dublety paralelních vláken na koncích β-sendvičů, známé jako mechanické svorky66.Předpokládá se, že tento motiv zvyšuje odolnost vůči smykovým silám, což je cenné pro proteiny zapojené do mezibuněčných interakcí.Navzdory této podobnosti s adheziny však v současné době neexistuje žádný důkaz, že SPACA6 interaguje s vaječnými bílky.Ektodoména SPACA6 není schopna se vázat na JUNO a buňky HEK293T exprimující SPACA6, jak je zde ukázáno, jen stěží interagují s oocyty postrádajícím zonu32.Pokud SPACA6 vytvoří mezigametické vazby, mohou tyto interakce vyžadovat posttranslační modifikace nebo být stabilizovány jinými proteiny spermií.Na podporu posledně uvedené hypotézy se spermie s deficitem IZUMO1 vážou na oocyty, což dokazuje, že v kroku adheze gamet se podílejí i jiné molekuly než IZUMO127.
Mnoho virových, buněčných a vývojových fúzních proteinů má vlastnosti, které předpovídají jejich funkci jako fuzogenů.Například virové fúzní glykoproteiny (třídy I, II a III) mají hydrofobní fúzní peptid nebo smyčku na konci proteinu, který je vložen do hostitelské membrány.Mapa hydrofility IZUMO143 a struktura (určená a předpovězená) nadrodiny IST nevykazovala žádný zjevný hydrofobní fúzní peptid.Pokud tedy nějaké proteiny v superrodině IST fungují jako fuzogeny, činí tak způsobem odlišným od jiných známých příkladů.
Závěrem lze říci, že funkce členů superrodiny IST proteinů spojených s fúzí gamet zůstávají vzrušujícím tajemstvím.Naše charakterizovaná rekombinantní molekula SPACA6 a její vyřešená struktura poskytne pohled na vztahy mezi těmito sdílenými strukturami a jejich roli v připojení a fúzi gamet.
Sekvence DNA odpovídající predikované lidské ektodoméně SPACA6 (přístupové číslo NCBI NP_001303901.1; zbytky 27–246) byla kodonově optimalizována pro expresi v buňkách Drosophila melanogaster S2 a syntetizována jako genový fragment se sekvencí kódující Kozak (Eurofins Genomics).sekreční signál BiP a odpovídající 5' a 3' konce pro klonování tohoto genu nezávislé na ligaci do expresního vektoru pMT založeného na metalothioneinovém promotoru modifikovaném pro selekci puromycinem (pMT-puro).Vektor pMT-puro kóduje místo štěpení trombinem následované 10x-His C-terminální značkou (obrázek S2).
Stabilní transfekce vektoru SPACA6 pMT-puro do buněk D. melanogaster S2 (Gibco) byla provedena podobně jako protokol použitý pro IZUMO1 a JUNO43.Buňky S2 byly rozmraženy a pěstovány v Schneiderově médiu (Gibco) doplněném 10% (obj./obj.) tepelně inaktivovaným fetálním telecím sérem (Gibco) a IX antimykotickým antibiotikem (Gibco).Buňky časné pasáže (3,0 x 106 buněk) byly umístěny do jednotlivých jamek 6-jamkových destiček (Corning).Po 24 hodinách inkubace při 27 °C byly buňky transfekovány směsí 2 mg vektoru SPACA6 pMT-puro a transfekčního činidla Effectene (Qiagen) podle protokolu výrobce.Transfekované buňky byly inkubovány po dobu 72 hodin a poté sklizeny s 6 mg/ml puromycinu.Buňky byly poté izolovány z kompletního Schneiderova média a umístěny do média Insect-XPRESS bez séra (Lonza) pro produkci proteinu ve velkém měřítku.1 l šarže buněčné kultury S2 byla pěstována na 8–10 × 106 ml-1 buněk ve 2 l ventilované polypropylenové Erlenmeyerově baňce s plochým dnem a poté sterilizována s konečnou koncentrací 500 µM CuSO4 (Millipore Sigma) a sterilně filtrována.indukovaný.Indukované kultury byly inkubovány při 27 °C při 120 otáčkách za minutu po dobu čtyř dnů.
Kondicionované médium obsahující SPACA6 bylo izolováno odstředěním při 5660 x g při 4 °C následovaným filtračním systémem Centramate s tangenciálním průtokem (Pall Corp) s 10 kDa MWCO membránou.Naneste koncentrované médium obsahující SPACA6 na 2ml kolonu s agarózovou pryskyřicí Ni-NTA (Qiagen).Pryskyřice Ni-NTA byla promyta 10 objemy kolony (CV) pufru A a poté byl přidán 1 CV pufru A, aby se získala konečná koncentrace imidazolu 50 mM.SPACA6 byl eluován 10 ml pufru A doplněného imidazolem na konečnou koncentraci 500 mM.Trombin restrikční třídy (Millipore Sigma) byl přidán přímo do dialyzační hadičky (MWCO 12-14 kDa) v množství 1 jednotka na mg SPACA6 vs. 1 1 10 mM Tris-HCl, pH 7,5 a 150 mM NaCl (pufr B) pro dialýzu.) při 4 °C po dobu 48 hodin.Trombinem štěpený SPACA6 byl poté třikrát zředěn, aby se snížila koncentrace soli, a nanesen na 1 ml MonoS 5/50 GL kationtoměničovou kolonu (Cytiva/GE) ekvilibrovanou 10 mM Tris-HCl, pH 7,5.Kationtoměnič byl promyt 3 CV 10 mM Tris-HCl, pH 7,5, potom byl SPACA6 eluován lineárním gradientem 0 až 500 mM NaCl v 10 mM Tris-HCl, pH 7,5 po dobu 25 CV.Po iontoměničové chromatografii se SPACA6 koncentroval na 1 ml a eluoval se izokraticky z kolony ENrich SEC650 10 x 300 (BioRad) ekvilibrované pufrem B. Podle chromatogramu se spojily a koncentrovaly frakce obsahující SPACA6.Čistota byla kontrolována elektroforézou barvenou Coomassie na 16% SDS-polyakrylamidovém gelu.Koncentrace proteinu byla kvantifikována absorbancí při 280 nm pomocí Beer-Lambertova zákona a teoretického molárního extinkčního koeficientu.
Purifikovaný SPACA6 byl přes noc dialyzován proti 10 mM fosforečnanu sodnému, pH 7,4 a 150 mM NaF a zředěn na 0,16 mg/ml před analýzou pomocí CD spektroskopie.Spektrální skenování CD s vlnovou délkou 185 až 260 nm bylo shromážděno na spektropolarimetru Jasco J-1500 s použitím křemenných kyvet s délkou optické dráhy 1 mm (Helma) při 25 °C rychlostí 50 nm/min.CD spektra byla korigována na základní linii, zprůměrována z 10 akvizic a převedena na střední zbytkovou elipticitu (θMRE) ve stupních cm2/dmol:
kde MW je molekulová hmotnost každého vzorku v Da;N je počet aminokyselin;θ je elipticita v miligradech;d odpovídá délce optické dráhy v cm;koncentrace bílkovin v jednotkách.